细胞色素c活力测定方法概况
细胞色素c氧化晦 （Cytochrome e oxidase,COX)亦称细胞色素氧化酶,存在于真核生物细胞的线粒体上,主要通过氧化磷酸化为细胞提供能量,是线粒体电子传递链末端氧化。COX单体为2-亚铁血红素,23)铜蛋白,相对分子质量为150~200kuKD)COX的每个单体由至少13条不同的肽链组成,分为3个亚单位。在真核细胞中,COX是由线粒体基因组与核基因组各自编码的亚基共同组成的复合物,以二聚体形式存在。COX可以催化还原型细胞色素C氧化将电子最终传递给O2:同时COX具有质子泵功能,将H"泵出线粒体内膜,用于合成 ATP. COX作为线粒体的标志酶,其活力的发挥是维持线粒体功能,进行细胞能量代谢的关键。目前评价COX活力方法主要有分光光度法、组织化学法以及极谱法,但由于采用的方法不同,测定条件週异,即使是同一器官COX活力测定往往出现不同的结果,致使不同研究的结果无法进行比较。因而,对COX活力检測方法的优化和标准化显得尤为重要。本文简要综述近年来COX活力检测方法,为COX的毒理学应用及其COX活力检测试剂盒的研发提供参。
1.COX的活力与机体的功能状态
COX自1929年首次被发现后,一直受到生物能学家的关注。很多研究显示,其活力与机体代谢异常疾病及中毒关系密切。①与细胞能量代谢的关系:功能活跃的器官,胞内COX活力较强,这与该器官线粒体丰富有关。在人体中脑、肝等重要器官的COX活力较高。②与细胞調亡的关系:线粒体合成ATP的功能依赖线粒体内膜的电子传递链,相关机制研究认为COX活力下降导致细胞的ATP水平从而降低启动湖亡,另一机制是COX活力改变,可使线粒体内跨膜电位朋潰,而该线粒体膜电位下降使膜电位通透转换孔开放,细胞色素C释入胞浆启动 Caspase系统导致细胞调亡。(3与体内微量元素的关系:COX是含铜,铜缺乏可导致COX活力下降,氧化磷酸化受抑制ATP生成减少,影响细胞的能量代谢有文献报道铁缺乏时,大脑COX活力降低,影响记忆和认知能力りVygodina等“的研究表示锌离子浓度增加可抑制COX活力,并推测这可能与锌离子改变COX内质子路径有关。最新研究还显示铁、铜以及其他元素在COX中的排列分布状况,可以帮助科学家发现细胞内某些新陈代谢过程发生差错的原因,找到治疗过早衰老、神经系统功能衰退,肥胖等相应疾病的方法和药物。4与氧的关系:实验证明COX在长时间缺氧环境中,其最大活力呈可逆性下降。抑制机制可能是缺氧引起的COX另一结合位点的变构造成其催化作用的可逆性变化,且缺氧COX活力改变常引起中枢神经系统功能障碍:而高压氧则可使COX活力增高。⑤与中毒的关系:氧化物中毒可抑制COX正常活力,并件有自由基的显著增多,这可能与线粒体电子传导受阻漏出,从而使O2和H2O3产生的可能性增加有关的,化物对COX的抑制作用尤以大脑最明显:二氯甲烷中毒,在机体内代谢产生高浓度一氧化碳也能与COX的Fe2结合,阻断呼吸链:硫化氢、砷化物和甲醇等中毒也是通过抑制COX活力而阻止细胞的氧化过程目前有学者研究发现含氮化合物能对抗CO和氯化物对COX的抑制作用,⑥与疾病的关系:研究提示某些神经系统疾病如阿尔茨海默氏症和帕金森病,脑区COX活力降低或功能不良:长期饮酒,酒精使心肌细胞超微结构发生异常,COX活力减弱,进而影响心机功能:吗等麻醉品的使用与COX活力之间的关系也有相关报道。
2.常见细胞色素c氧化酶活力用于检测
COX活力的方法很多,常用的有紫外分光光度法,组织化学法,极谱测定法等。
2.1分光光度法
2.1.1测定的基本原理:根据细胞色素e6ytc)的还原型和氧化型有不同的光吸收这一原理,通过测量还原型cte的氧化率来反映COX的活力。此法较为常用,鉴于其操作简使,目前应用也最为广泛。
2.1.2测定的基本操作程序:常规制取组织和细胞匀浆后,根据不同器官来源的组织和eytc的纯度,取定浓度的cyte于比色管中,加入缓冲溶液和适量的还原剂如保险粉)后摇匀,在波长550nm测得吸光度值,然后加组织匀浆液,立即开始计时,随后每间隔定时间测定一次吸光度值,持续测定5min左右。以最小二乘法计算经原点线求其斜率K值。即为cte氧化速率常数,代表COX活力。
2.1.3测定的重要影响因素及其优化:影响COX活力测定的主要因素:4)匀浆介质的离子浓度。早在1951年,就有科学家提出,K磷酸盐缓冲液浓度不同,可以获得不同的COX活力值:优化离子浓度研究发现,K“磷酸盐缓冲液浓度为40-60mmol/L时,COX活力最高。2)缓冲液的选择。常用缓冲液有:磷酸盐缓冲液,Tns三羟甲基氨基甲烷)缓冲液等。磷酸盐缓冲液因其pH受温度的影响小,稀释后pH变化小,被广泛运用。而 Tris-hci缓冲液碱性较强,所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液。可以根据样品的实际要求,结合各缓冲液的优缺点进行理想的线冲液选择。6)线粒体膜结构的提纯:实验中,为了保存或促进海的活力,常提纯线粒体,以获得较高的活力。也常用去垢剂处理样本,应用较多的破膜剂w니和月桂酰基麦芽糖苷。但也有学者提出,如果样本无需长时间储存,可以不用破膜剂处理,4)保险粉Na2S2O2的用量:保险粉为强抗氧化剂。预研结果发现,不同脏器保险粉的用量应有较大区别,否则不能测得有关脏器的COX值,但对其具体用量,应视脏器而定。
2.2极谱记录仪测定法
2.2.1基本原理:根据还原型cyte被氧化的同时消耗O2这一原理,通过测量反应体系中氧耗率来反映酶活力。早在1983年, Rafael就提出极谱法测定COX活力更具优越性。
2.2.2测定方法的操作程序的:设定反应总体积,就反应底物和反应标本量的不同测量酶的活力,设置平行管。缓冲液孵育使液体被空气充分饱和,加入相应量的eyte,反应1-2min,待反应曲线斜率反应空白值)恒定以后,加入样本,并记录氧耗曲线,用脚活力计算公式求得COX活力值
2.2.3测定方法的主要影响因素及其优化:D样本的选择:用以检测活力的样本一段为组织匀浆和线粒体,纯化线粒体样品检出的COX活力值效果较好,这可能与组织匀浆中多种成分如磷脂,脂肪酸等抑制了的活力有关。2底物浓度的选择:测定COX活力的底物一般选择eyte,但由于cyte价格昂贵,有学者做过对比研究提示在反应体系中同时加入某些强还原剂如抗坏血酸、TMPD测定的COX活力值稳定与单用yte作底物时测定的值没有显著差异,且大大减少了cyte的用量,节约经费。
2.3组织化学法
2.3.1组织化学法的原理:利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理,COX活力组织化学法检测有经典的Nadi反应以及DAB法。前者指对苯胺在氧化酶的作用下由于氧化而与酚类相伴合,形成哚酚呈色的反应。后者则是指3,3-二氨基联苯胺3,3 -diaminobenzidine,DAB)在细胞色素氧化的催化下,其侧链氨基被氧化,并进行反复氧化性聚合和氧化性环化,形成不溶性褐色吩嗪聚合体,对样本组织切片染色后,再结合灰度值或光密度测定酶的相对活力由于操作简单,且定量法敏感性高,并可用电镜观察提供高空间定位,所以该法被广泛应用,但不能用于活体检测。
2.3.2测定方法的操作程序:①制片:组织取材甲固定,切片,料育,单纯酸铀染色,二甲苯透明封片。②半定量法灰度值扫描”:图像分析系统扫描探头随机摄取分析,COX活力可通过染色扫描,以灰度值表示,灰度值越低,COX活力越高,反之亦然。(3)梅活力定量分析:显微镜镜检切片,获取图像,经专用图像分析软件计算处理,分别测定阳性产物的吸光度、平均截面积及体密度。
2.3.3测定方法的主要影响因素为固定剂的选用:要获得理想的染色切片,切片前的固定是关键因为离体组织COX活力容易丧失,良好结构和高效酶活力的固定剂是很重要的。通常运用1%多聚甲醛或2%度二隆,二者合用效果更佳。
2.4COX的分子影像学检测C0X组织化学法不能用于活体组织的检测,但近年来随着影像学及其先进设备的发展,目前己有一些实验性的成像系统通过高分辩能力,运用于脑无创检测的研究。如①红外光学成像技术NIRS):运用近红外区域的光穿入检测组织,通过特殊转换模型,可以获得吸收相应波长光的物质的浓度。(③功能性磁共振MR):COX活力可以通过细胞耗氧量来反映,FMRI通过测定氧化血红蛋白/脱氧血红蛋白比值来反映局部功能的酶活力。④正电子发射型计算机断层显像PET):PET利用种示踪剂电子放射性核素)进入人体跟踪成像,并获得人体细胞代谢活动的各种参数
3.展望
COX作为线粒体的标志酶,且在各个组织器官中活力不一。目前虽然已经出现一些测试试剂盒,但并不能准确反映各个器官中COX活力的特点,因而需要更为精确的测量方法及现有各类测试方法的优化,统一不同来源组织样品的测定方法,进而开发具有组织特异性的商品化试剂盒,更为准确反映COX活力状态,最终促进生物能学的发展
