SPE- RRLC法测定奶制品中的三聚氰胺
图1. 浓度与峰面积的回归曲线。
本方法采用SampliQSCX固相萃取小柱、亚二微米的ZORBAXSBC8RRHT反相色谱柱、离子对色谱法，快速分析了奶粉与液态奶中的三聚氰胺。分析方法采用反相色谱方法，色谱柱来源丰富，仪器配置简单，方法简便易行，可作为常规三聚氰胺筛查方法使用。分析既可在普通HPLC上进行，亦可在高分离度快速液相色谱（RRLC）上进行。
奶粉、液态奶试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经SampliQ-SCX阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱－离子对色谱法测定，外标法定量，可采用液相色谱-质谱/质谱或气相色谱-质谱或气相色谱-质谱/质谱确证。
采用ZORBAXSBC8和RX-C8反相色谱柱，以10mmol/L柠檬酸和10mmol/L辛烷磺酸钠溶液（pH=3.0）-乙腈（92:8）为流动相，检测波长240nm，流速1.5ml/min，柱温30℃。
实验及方法
仪器与材料
本实验使用安捷伦1200RRLC－DAD高效液相色谱系统（配置在线真空脱气机、二元泵、高性能自动进样器、柱温箱、紫外检测器）进行检测；电子天平为METTLER TOLEDO公司的AL104；pH计为METTLER TOLEDO公司的DELTA320；分析天平：感量为0.0001g和0.01g。离心机：转速不低于4000r/min；固相萃取装置（包括试管架、收集瓶、真空与流速调节阀等附件）；氮气吹干仪；阳离子交换固相萃取柱：SampliQ，150mg/6ml或60mg/3ml；定性滤纸；涡旋混合器；具塞塑料离心管。
图2. 0.8mg/ml三聚氰胺标样（上）与酸奶实际样品（下）重叠谱图。
试剂与标样
乙腈为迪马公司HPLC级乙腈；超纯水为经Milli-Q系统净化处理过的纯净水。
三氯乙酸溶液：准确称取50g三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。
氨化甲醇溶液：10mM离子对试剂缓冲液（pH3.0）：准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加入约980ml水溶解，调节pH至3.0后，定容至1L备用。
三聚氰胺标准贮备液：浓度1mg/ml，溶剂为乙腈/水（1：1）。
标准工作液：逐级稀释三聚氰胺标准贮备液，以流动相定容，制成浓度分别为0.8mg/ml，2.0mg/ml，20.0mg/ml，40.0mg/ml，80.0mg/ml的标准工作液。
样品制备
称取2g（精确至0.01g）试样于50ml具塞塑料离心管中，加入15ml三氯乙酸溶液和5ml乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min后，以4000r/min离心10min。上清液经滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25ml，精密移取5ml滤液，加入5ml水混匀后做待净化液。
图3. 液态奶、0.8ppm标准样品、液态奶添加8ppm三聚氰胺样品的色谱图比较。
将待净化液转移至6cc/150mg SampliQ固相萃取柱（小柱事依次先经5ml甲醇、6ml水活化）中。依次用5ml水和5ml甲醇洗涤，抽至近干后，用5ml氨化甲醇溶液（5%）洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1ml/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物（相当于0.4g试样）用1ml流动相1定容，涡旋混合1min，过0.2mm微孔滤膜。
RRLC色谱条件
RRLC：ZorbaxSB-C84.6x50mm，1.8mm；
流动相：10mM离子对试剂缓冲液（pH3.0）：乙腈＝92：8；进样量：8μL；检测波长为240nm；流速：1.5ml/min；柱温30℃。
结果与讨论
样品前处理
SPE过程采用安捷伦新近推出的SampliQSCX固相萃取小柱。该小柱使用简单，重现性良好，对奶粉与液态奶的提取可以获得稳定和良好的回收率。本实验中，采用的6cc/150mgSampliQSCX小柱，对液态奶的回收率为90%。本应用亦可选用3cc/60mgSCX小柱进行。
图4. 某品牌奶粉样品（下）与0.8ppm标准样品（上）的谱图比较。
样品的液相色谱分析（RRLC）
线性范围与检出限：以0.8mg/ml，2.0mg/ml，20.0mg/ml，40.0mg/ml，80.0mg/ml的标准工作液绘制标准曲线，得到线性回归方程y=17.76x-3.07，相关系数R2=0.99996（图1）。计算检出限（三倍信噪比）约为0.03mg/ml。
实际样品的分析结果：使用现有方法可以良好分析经SPE处理后的奶粉与液态奶实际样品中的三聚氰胺。一次分析可在6min内完成。其中三聚氰胺保留时间在2.8min，后续时间为清洗杂质的时间。如果需要加快分析速度，可采用2ml/min的流速，以进一步缩短分析时间。
结论
本方法采用SampliQSCX固相萃取小柱、亚二微米的ZORBAXSBC8RRHT反相色谱柱、离子对色谱法可以快速分析奶粉与液态奶中的三聚氰胺。样品提取与净化使用了安捷伦公司新近推出的阳离子交换机理的SampliQSCX固相提取小柱，获得了良好与稳定的回收率结果。分析方法采用最普遍使用的反相色谱方法，色谱柱来源丰富，仪器配置简单，方法简便易行，可作为常规三聚氰胺筛查方法使用。分析既可在普通HPLC上进行，亦可在高分离度快速液相色谱（RRLC）上进行，后者可大大提高分离速度。
