相对 RT-PCR: 引物与竞争子比例的决定实验
试剂、试剂盒 双蒸水RT-PCR 缓冲液TaqDNA 聚合酶cDNAdNTP 混合物基因特异的正向引物基因特异的反向引物dCTP
仪器、耗材 PCR 仪 PCR 管Quantum RNA Universal 18S standards
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
去除 RNA 酶的双蒸水
10XRT-PCR 缓冲液（100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKC1，15 mmol/LMgCl2)
2. 酶和酶缓冲液
Taq DNA 聚合酶（5U/ul)
3. 核酸和寡核苷酸
cDNA(来自方案 1)
dNTP 混合物（10 mmol/L, 包含所有四种 dNTP)
基因特异的正向引物（5umol/L)
基因特异的反向引物（5umol/L)
4. 放射性复合物
[a-32P]dCTP(10uCi/ul)(1Ci=37 GBq)
5. 实验器材
Quantum RNA Universal 18S standards(Ambion; 包括 18SPCR 引物对和 18SPCR 竞争子）
薄壁的 PCR 管
6. 专用仪器
可编程的 PCR 仪
二、方法
1.引物与竞争子的比例如下。
2.在冰上准备 PCR 反应混合物 。
cDNA 5.5ul
10XRT-PCR 缓冲液 27.5ul
10 mmol/LdNTP 混合物 22ul
5U/ulTaqDNA 聚合酶 1.4ul
去除 RNA 酶的 ddH2O 177ul
[a-32P]dCTP(10uCi/ul) 2.5ul
3.平均在每个 PCR 管中加入 42ulPCR 反应混合物，共 5 管，分别标记 1~5。
4.在 1~4 管中，分别在每个管中加 2ul 基因特异的正向引物（5umol/L) 和 2ul 基因特异的反向引物（5umol/L)。
5.如下所示加入 18SrRNA 引物和竞争子的混合物。
在 2 号管中加入 1:9 混合物 4ul
在 3 号管中加入 2:8 混合物 4ul
在 4 号、5 号管中加入 3:7 混合物 4ul
6.进行 PCR 扩增，如方案 1 所述，使用扩增线性范围决定的最佳循环数。
7.如方案 1 所述，用变性凝胶电泳来分析实验结果。检测哪一个泳道的 18SrRNA 产物的量最接近基因特异性产物的表达量，这一样品中引物与竞争子的比例在后续的相对 RT-PCR 实验中使用。
