离心机-离心法提取食品中的DNA
1、从新鲜或冷冻材料提取 DNA
（1）DNA 的粗提
①试剂
a.2倍 CTAB 提取缓冲液：100mmol/L Tris·Cl（pH8.0）,20 mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2％CTAB，40mmol/Lβ-巯基乙醇。
b.10％CTAB：10％CTAB，0.7mol/L NaCl。
c.1倍 CTAB 沉淀缓冲液：50mmol/L Tris·Cl（pH8.0），10mmol/L EDTA，1％CTAB，20mmol/Lβ-巯基乙醇。
②操作
a.取1～50g 新鲜植物材料，于液氮中研成粉。
b.将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入等体积65℃预热的2倍 CTAB 提取缓冲液充分混匀，65℃保温10～20min，其间不时摇动。
c.加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000r/min 离心10～20min。
d.将上清液转入另一离心管中，加入1/10体积的10％CTAB，混匀，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温、12000r/min离心10min。
e.取上相，重复d操作1次。
f.将上相转入新的经硅烷化处理的离心管中，加入1～1.5倍体积的1倍 CTAB 沉淀缓冲液，混匀，室温下放置30min，观察沉淀生成。如无明显沉淀生成，延长放置时间，随放置时间延长，沉淀量增加。
g.3500～4000r/min 离心5～10min，去上清液，沉淀吹干，备纯化用。
（2）DNA 粗提物的纯化
方法I
①试剂
a.1mol/L 乙酸铵。
b.7.5mol/L 乙酸铵。
②操作
a.按 0.5mL/g 材料的比例加入1mol/L 乙酸铵溶液，使沉淀溶解完全，再加入7.5mol/L 乙酸铵至终浓度为2.5mol/L。
b.加入2倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。
c.用细玻璃棒缠出 DNA 纤维，或10000min 离心5min，弃去上清液。
d.用70％乙醇漂洗沉淀，吹干，沉淀溶于适量TE。
e.加入1μL 1mg/mL RNase，于4℃放置，备用。
方法Ⅱ
①试剂
a.CsCl 梯度溶液：取 TE 缓冲液（pH8.0）25mL，加入CsCl 25g，溶解后按 5mg/mL 比例加入 EB。
b.异丙醇溶液：向任意量的异丙醇中加TE缓冲液至两相出现，搅拌状态下缓慢加入固体CsCl 至下相（TE 相）中出现白色沉淀，将两相混匀。
②操作
a.向粗提的 DNA 沉淀加入适量 CsCl 梯度溶液，置50℃水浴中轻搅溶解。
b.将溶解好的梯度液转入超速离心管中严格平衡，封管，20℃、50000离心力离心过夜。
c.取出离心管，置紫外灯下观察 DNA 条带，穿刺取出，转至另一离心管中。
d.加入等体积的异丙醇溶液，轻缓混匀，静置至分层，去上层。
e.重复 d 抽提数次，至紫红色消失。
f.去除 EB 的下相中加入2倍体积的 TE 缓冲液稀释，混匀，加入2倍体积的异丙醇，混匀，室温下放置10min。
g.12000离心力离心10min，沉淀溶于适量TE缓冲液中。
2、从干燥材料中提取
（1）粗提
①试剂
a.1倍 CTAB 提取缓冲液：2倍 CTAB 贮存液稀释1倍，使用前每100mL 加入巯基乙醇0.14mL。
b.其他试剂与从新鲜材料中提取相同。
②操作
a.称取 1g 干燥材料置研钵中，加入3～4g 铝粉研磨。
b.将粉末转入离心管中，加入0.6～15mL 1倍 CTAB 提取缓冲液，轻缓地搅拌，使材料充分分散。置56℃水浴中保温10～20min。
c.冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀。20℃、8000离心力离心10min。
d.将上相转入另一离心管中，加入0.1体积的10％ CTAB 溶液，轻轻混合，重复c，d操作。
e.加入等体积的1倍 CTAB 沉淀缓冲液轻轻混匀，室温下放置 30min 或更长。
f.室温条件下，1500离心力离心10min，去上清液，沉淀纯化。
（2）粗提物的纯化
①小量制备物的纯化
试剂
a.Imol/L NaCl。
b.65％，80％无水乙醇。
操作
a.将沉淀溶于 400L 1mol/L NaCl 中可置56℃水浴中助溶。
b.加入2倍体积的无水乙醇，于一70沉淀30min，或20℃过夜。
c.15000r/min 离心2min。去上清液。
d.先后用65％，80％乙醇，漂洗沉淀，吹干，溶于无菌蒸馏水中。
②大量制备物的纯化
试剂
a.1mol/L CsCl/EB溶液：50mmol/L Tris·Cl（pH8.0）,10 mmol/L EDTA，1 mol/L CsCl，0.2mg/mL EB。
b.7mol/L CSCl/EB 溶液：7mol/L CsCl，0.1％sarkosyl，0.2mg/mL EB。
操作
a.向沉淀加入 2.4mmol/L CsCl/EB 溶液，于56℃水浴中溶解。
b.将溶液转入到 Beckman VTi65 超速离心管（或其他可替代的离心管）中，加入2.9mL7mol/L CsCl/EB 溶液，平衡，密封管口，轻轻倒置混合。
c.用 VTi65 转子58000r/min 离心4h，或40000r/min 离心16h。
d.320nm 紫外光照射下观察 DNA 的红色带，用16号针头的1mL 注射器从离心管侧面穿刺抽取 DNA。
e.用 CsCl 饱和的异丙醇反复抽提 DNA，至抽提液无明显红色（去除EB）。
f.将 DNA 样品置透析袋中，于4℃蒸馏水中透析24h，其间更换蒸馏水3～4次。
g.透析液转入离心管中，加入1/10体积的3mol 二乙酸钠，及2倍体积的冷乙醇，混匀，于20℃沉淀过夜（或-70℃放置30min）。
h.80000离心力离心15min，去上清液真空干燥 DNA 沉淀。用适量的 TE 溶解。
3、说明
使用 CTAB 法时，操作中需要注意如下问题。
（1）最好使用幼嫩的材料，材料含水量大时，可用70％乙醇擦拭，蒸馏水稍冲洗后用滤纸吸干，于液氮中研磨。如果材料量大（20g以上），或所用的植物材料较老，或材料含有较多的酚类物质，应提高β-巯基乙醇的用量。
（2）氯仿抽提时，要保证抽提液中有一定的盐浓度，否则 DNA 进入沉淀。
（3）CTAB 溶液在15℃以下会沉淀，因此离心和其他操作时不可在低温下进行。
（4）加入沉淀缓冲液应在高于15℃的室温下沉淀，如果室温适宜，沉淀时间足够而无沉淀出现，可能是盐浓度高，这时可再加入沉淀缓冲液降低盐浓度。离心收集 CTAB 沉淀缓冲液沉淀的 DNA 时，不能离心过度，高速度及长时间的离心都会使沉淀过紧，而再溶解困难。
（5）采用真空抽干沉淀时，不能抽得太干抽得太干会使 DNA 断裂，也可不采用真空抽干，将离心管置通风柜或超净工作台中令乙醇自然蒸干，这样对 DNA 造成的损伤小。
（6）10％的 CTAB 溶液很粘滞，取液时可将其加热至56℃。
（7）转移 DNA 溶液用的枪头要剪去尖，避免对 DNA 的机械损伤。
（8）所得 DNA 应为白色或灰白色，若呈褐色则有多酚物质污染。对于含多酚类物质多的材料，提取缓冲液中可加入1％的 PVP。对于多糖含量高的材料，提取液中 CTAB 的浓度可增至3％或更高。
