SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外源蛋白的表达
| 实验方法原理 | SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法。它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。打开的肽链靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同的大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、试剂配制 1．1.5mo1／L Tris-HCl pH 8.8 (已加SDS ) 2．0.5mo1／L Tris-HCl pH 6.8 (已加SDS) 3．10％SDS 4．30％Acr／Bis 29.2g Acr + 0.8gBis，用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放。 5．10％Ap (-20℃存放) 6．2x样品缓冲液 0.5mo1／L Tris-HCl pH6.8 2mL 甘油 2mL 20％SDS 2mL 0.1％溴酚蓝 0.5mL 2—β—巯基乙醇 l.0mL 双蒸水 2.5mL 7．5x电极缓冲液 Tris 7.5g G1y 36 g SDS 2.5g 双蒸水溶解，定容至500mL，使用时稀释5倍使用 8．染色液：0.2g考马斯亮蓝R250 + 84mL 95％乙醇 + 20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用。 9．脱色液： 酒精：冰醋酸：水＝7.5：7.5：85 二、实验步骤 1．装配做胶用的玻璃板"三明治"：做1.0mm厚的胶。选择两侧的玻璃夹条为1mm的玻璃板，将其夹条面朝上平放在桌面上，把灰色的U形硅胶夹条在上面摆好，然后把带两个“耳朵”的凹玻璃放在上面，使U形硅胶夹条平整、服帖地夹在两块玻璃板之间。小心地把这玻璃板“三明治”放到“提篮架子”上，用塑料的“楔子”夹紧，注意底部的U形硅胶夹条在夹紧的过程中依然保持平整、服帖。在玻璃板“三明治”的夹缝加满蒸馏水，检验是否漏，如果漏水必须重装。 2．配制浓度为12％的分离胶 (凝胶浓度应根据被分离蛋白的分子量进行选择)，配方如下： 双蒸水 3.3 mL 1.5mo1／L Tris-HCl (pH 8.8) 2.5 mL Acr／Big(30％) 4.0 mL 10％ SDS 100 μL TEMED 10 μL 10％AP 100 μL 总体积 10 mL （刚好灌制两块胶） 混匀后加入两玻璃夹缝中，并小心在胶面上加入1cm蒸馏水(在胶面上加蒸馏水称水封，目的是保持胶面平整，并防止胶与空气接触，影响胶的聚合)，室温放置，等胶自然凝聚后（此时在胶面与水封之间可见清晰的界限），将水封倾去。这时可以开始配制4％的浓缩胶，配方如下： 双蒸水 1.8 mL 0.5mo1／L Tris-HCl pH 6.8 0.75mL Acr／Bis (30％) 0.4 mL 10％ SDS 30 μL TEMED 5μL 10％Ap 30μL 总体积 3.0 mL （够做两块板的浓缩胶） 混匀后加入到"三明治"玻璃板的夹缝中，然后在把1mm的梳子插进浓缩胶中，注意在梳子和浓缩胶之间不要留有气泡。如果发现有较大的气泡，一定要想法去掉（可以插拔梳子或指弹气泡处的玻璃等），否则会影响电泳结果。待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。如果发现拔出梳子后形成的加样孔之间的间隔发生扭曲，用注射器的针头小心加以整理，使之齐整。 3．细菌培养物SDS-PAGE样品的制作：同时做L-阿拉伯糖诱导的和未加L-阿拉伯糖的两个大肠杆菌样。取细菌培养物1.5mL加到1.5mL小离心管中，12000r/m离心3分钟，去上清。在离心沉淀中加约等体积的蒸馏水，用枪头小心地吹打，使细菌充分悬浮，直到没有明显的小团块，然后加入等体积的2×样品缓冲液，在100℃沸水浴(或干式培养器)中保温5min。此时如用枪头吸取样品，会发现非常粘稠，呈鼻涕状，这是因为有样品中含有大量DNA的结果。要用胰岛素注射器将样品从极细的针头中打出，反复多次才能将DNA分子打断，使样品变得不再粘稠为止。将样品14000r/m离心5分钟，使不溶物沉淀下来，小心吸取上清加样。电泳样品的处理直接关系到电泳结果的好坏，一定要认真做样，否则跑不出好胶来。 4．琼脂封底：做好胶后，把玻璃板“三明治”从架子中取出，将两玻璃板之间的硅胶夹条去掉。去掉夹条后在凝胶的底部会留下一空隙，此空隙要用2%融化的琼脂填满，否则在玻璃板浸到电极缓冲液后空隙中的空气将很难彻底排除掉，电泳时会明显影响导电，严重时会使整个电泳失败。琼脂封底时注意不要产生气泡。 5．电泳槽组装：封底后将玻璃板“三明治”凹玻璃面向内重新装到“提篮架子”上，固定好后，将整个部件放到电泳槽的外壳中，然后加电极缓冲液。加液时要使内外槽中的液面基本等高，内槽液的液面要高出玻璃板“三明治”的凹玻璃至少5mm，以保证能够导电，且电场均匀。 6．加样：按事先设计好的顺序与加样量依次加样。在样品的浓度未知的情况下，同一样品可加一梯度，即每一泳道的加样量依次减半。这样，在做第二次电泳时可以其作为参考，正确加样。蛋白分子量标准可以加在靠中间的加样孔中，也可加在离边的第2道处（最靠边的一道样品往往会明显跑斜）。 7．电泳：将电泳槽的盖子盖上，把电泳槽的两个电极接到电泳仪上（注意电极不要接错），然后接通电源。先将电压调到80V，当样品进入分离胶时，调节电压使恒定在150V。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，关掉电源，停止电泳。将玻璃板从电泳槽中取出，小心地用旧的电话卡撬开两玻璃板，暴露出胶面。将浓缩胶部分去掉不要，分离胶放到塑料盒中染色。 8．染色和脱色：凝胶在考马斯亮蓝染色液中染色20分钟（摇床上缓慢振荡），然后倾去染色液（染色液回收，可反复用数十次），用自来水洗几下，去掉凝胶上和塑料盒中的染色残液，加脱色液脱色（摇床上缓慢振荡），1小时后换一次脱色液，振荡脱色过夜。彻底脱色后的凝胶蛋白条带清晰，背景透明干净。这时可以将凝胶拍照或用扫描仪进行扫描，作为永久记录。 |
| 注意事项 | 1. 样品处理 上样缓冲液的作用：形成SDS-蛋白复合物，使其带负电：SDS和巯基乙醇使蛋白质解离，综上两点为了在电泳中，只根据分子量来分离。 SDS作用：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠，还有助溶剂的作用。 2. SDS-PAGE电泳凝胶 浓缩与分离胶凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。 3. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径 待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 4. “微笑”（两边翘起中间凹下）形成原因 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再做后续实验。 5. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形成原因、 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 6. 条带出现拖尾现象 主要是样品溶解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。 7. 条带出现纹理现象 主要是样品不溶性颗粒引起的。 处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。 8. 溴酚蓝不能起到指示作用 实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。 处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。 9. 电泳的条带 电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。 处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压。 10. 电泳电压很高而电流却很低 比如电压50V以上，可电流却在5mA以下。主要由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b. 外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。 11. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳影响 一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。 12. 凝胶时间不对，或慢或块 通常胶在30min内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。 13. 电泳时间比正常要长 可能由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的pH选择错误，即缓冲系统的pH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。 14. 分离胶加上后为什么要立即加水 加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。 展开 |
