有机磷急性中毒家兔乙酰胆碱酯酶活性变化
实验概要
了解有机磷中毒的症状，观察阿托品和解磷定对有机磷中毒解救的效果及乙酰胆碱酯酶活性变化。
实验原理
有机磷是剧毒农药,可抑制胆碱酯酶,使体内积聚大量的乙酰胆碱,导致M、N样症状;阿托品和解磷定可分别解除M样症状和恢复酶的活性,可达到解救目的。
主要试剂
0.2% （V/V） DDV (敌敌畏)
1mg/ml Atropine sulfate solution (硫酸阿托品溶液)
25mg/ml Pyraloxime iodide (碘解磷定溶液, PAM-1)
500U/ml Heparin N.S solution (肝素生理盐水溶液)
pH7.2 Phosphate buffer saline (磷酸盐缓冲液)
0.007M Ach substrate application solution (乙酰胆碱底物应用液)
Alkaline hydroxylamine solution (碱性羟胺溶液)
33.3％（V/V） Hydrochloric acid solution (盐酸溶液)
10% Trichloride ferric solution （三氯化铁溶液）
N.S (Normal saline, 生理盐水)
主要设备
恒温水浴 家兔固定箱 1ml、2ml、5ml、10ml注射器 10ml试管试管架 漏斗 滤纸 婴儿秤 5ml加样器 1ml加样器 200ul加样器 100ul加样器
实验材料
动物： 家兔(2.5kg左右)
实验步骤
1. 取家兔2只,编号（甲、乙）称重,观察下列生理指标并分别纪录：活动情况、呼吸、瞳孔大小、唾液分泌、大小便、肌张力及有无震颤等。
2. 将家兔分别固定于兔固定箱中，用500U/ml肝素（或10％草酸钠）湿润过的注射器由耳缘静脉每兔抽血0.5ml ,作为用药前血样。然后各兔均由耳缘静脉注入0.2％敌敌畏0.1ml/kg。密切注意上述各项生理指标的变化。
3．当中毒症状明显时，按前法每兔取血0.5ml，为农药中毒血样。继而立即给甲兔iv 1mg/ml Atropine sulfate solution 2ml/kg; 乙兔iv 25 mg/ml的PAM-1 ，剂量为2ml/kg。给药过程中和给药后密切观察各项生理指标的变化，注意各兔的区别和给药后好转的时间（观察结果填入表1）
表1 家兔各项生理指标的变化
兔号 | 体重 | 观察时间 | 活动情况 | 呼吸情况 | 瞳孔大小 | 唾液分泌 | 大小便情况 | 肌张力大小 | 肌震颤程度 | 给药后好转的时间 |
甲 | 给DDV前 | |||||||||
给DDV后 | ||||||||||
给atropine后 | ||||||||||
乙 | 给DDV前 | |||||||||
给DDV后 | ||||||||||
给PAM-1后 |
4. 待中毒症状明显消失后20分钟，再以同样法取血0.5ml，为治疗后血样。
5. 取上述三次待测血液样本，每一份血样都要分标准管、测定管和空白管，测定方法均按下表所示操作步骤进行。操作时，每加一种试剂均需充分摇匀，并严格控制保温时间。
表 2 全 血 胆 碱 酯 酶 测 定 操 作 步 骤
步 骤 | 标 准 管 （ml） | 测 定 管 (ml ) | 空 白 管 (ml ) |
（1）pH7.2磷酸盐缓冲液 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
（2）全血 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
（3）37℃ | 水 浴 预 热 3 分 钟 | ||
（4）乙酰胆碱底物应用液 | 1.0 | ||
（5）37℃ | 水 浴 保 温 20 分 钟 | ||
（6）碱性羟胺溶液 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
（7）乙酰胆碱底物应用液 | 1.0 | ||
（8）室温 | 静 置 2 分 钟 | ||
（9）33.3％（V/V）盐酸溶液 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
（10）10%三氯化铁溶液 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
混匀2分钟后，分别过滤，于20分钟内，用酶标仪测定（选波长492nm），读取各管光密度。 | |||
胆碱酯酶活力单位计算公式：
标准管光密度－测定管光密度
胆碱酯酶活力（单位/ml）＝—————————————— ×70
标准管光密度－空白管光密度
以1ml血液在规定条件下能分解1µM乙酰胆碱的胆碱酯酶活力称为1个胆碱酯酶活力单位。式中“70”是由于每管中加有7µM乙酰胆碱，0.1ml血液，即7×1.0/0.1=70
注意事项
1.氯化乙酰胆碱在空气中易潮解，故需用具盖称量瓶尽快称好。
2.水浴温度和保温时间都能影响酶的反应，因此必须严格控制。
3.加三氯化铁溶液显色后，棕红色铁络合物易退色，故应在20分钟内比色完毕。如有大批样品需要分析，可分批加三氯化铁溶液。
4．若乙兔中毒症状严重，给PAM-1后应静脉注射阿托品1ml/kg。
