转录组高通量测序
（第二代高通量测序技术-454）
转录组即特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。罗氏GS-FLX-Titanium第二代高通量测序仪平均读长超过400bp，在测序读长上遥遥领先于其它第二代高通量测序仪，使其成为转录组学研究的首选测序平台，已被广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。
一、 罗氏454测序技术在环境微生物生态多样性研究中的突出优势体现在：
（1） 测序序列长，便于聚类拼接，可以对转录本进行从头组装（de novo assembly）。
（2） 测序通量高，可以检测到低丰度转录本信息。
（3） 可以对无基因组参考序列的新物种进行转录组测序，发现新的转录本和亚型。
（4） 实验操作简单、结果稳定，可重复性强。无需进行克隆的文库构建，双链cDNA连接454接头后可以直接进行测序，实验周期短。
（5） 测序数据便于进行生物信息分析，可以进行基因差异表达分析、鉴定基因的可变剪切以及预测新基因。
二、 美吉公司在环境微生物生态多样性研究中的突出优势体现在：
（1） 拥有自主实验室和高通量测序平台，可以根据客户要求灵活安排实验，实验周期短，取样方便，质量可靠。
（2） 技术人员经验丰富，可以稳定地进行总RNA的提取和双链cDNA的合成，可以根据顾客要求第一时间提供实验方案。
（3） 有专业的生物信息团队和大型计算机，可以为客户提供个性化的生物信息分析服务。
（4） 开放式实验室，参与式服务。客户不但可以参与整个实验过程，而且可以参与生物信息分析，提供最为增值的售后服务。
三、 服务流程
（1） 客户提供样本背景信息、实验目的和实验预期。
（2） 美吉公司设计实验方案，提供测序深度建议和生物信息分析建议。
（3） 客户认可实验方案，双方签订项目合作协议。
（4） 项目开始运作，美吉公司指定专人和客户保持无障碍沟通。
（5） 项目结束，美吉公司提供标准结题报告。
（6） 客户可以和美吉公司签订长期合作协议，享受折扣和VIP服务。
四、 送样要求
（1） 动物、植物、微生物组织：
> 请提供足量的新鲜样品，样品量≥5g；植物材料应避免过老的组织，尽量用柔嫩部位。
> 新鲜程度要求：采样后将样品立即液氮速冻－80℃保存（保存期不超过1个月），干冰运输，运输时间不超过72h。
> 样本保存期间切忌反复冻融。
> 样品质量合格与否的判断标准：RNA提取后经变性电泳，各RNA条带清晰，比例适中，完整性好，无降解。
> 填写完整的送样订单（请点击下载），提供尽量详细的物种基因组背景资料信息，如：基因组大小，基因平均长度，预计表达的基因数量等待。用自封袋密封后随同样本一起快递。
> 样本的送样量和其他具体要求，请致电免费电话400-660-1216。
（2） RNA
> 总RNA＞500ug，浓度＞1ug/ul；
> mRNA＞3ug，浓度＞50ng/ul；
> OD260/OD280为1.8-2.2；28S/18S＞1.8; RIN≥ 8（哺乳动物）
> 质检以我方电泳胶图、紫外分析仪定量为准。。
> 送样管务必标清样本编号，管口使用Parafilm膜密封。
> 样本保存期间切忌反复冻融。
> 送样时使用干冰运输。
> 填写完整的送样订单（请点击下载）和RNA电泳检测照片，用自封袋密封后随同样本一起快递。
（3） 双链cDNA
> 按照美吉公司提供的cDNA 454文库构建流程进行文库构建，去除文库中的POLY-A。
> 总量＞5ug，浓度＞50ng/ul，OD260/280在1.8左右。
> 送样管务必标清样本编号，管口使用Parafilm膜密封。
> 样本保存期间切忌反复冻融。
> 送样时使用干冰或冰袋运输。
> 填写完整的送样订单（请点击下载）和cDNA电泳检测照片，用自封袋密封后随同样本一起快递。
五、 无参考基因组转录组分析（de novo Transcriptome Analysis）
> 测序和基本数据处理
合成双链Cdna 酶切去POLY-A 两端连接454接头 454测序 基本数据处理（图像识别、碱基识别、过滤接头序列）
> 生物信息分析内容
* 数据产出统计及测序数据的成分和质量评估
* Contig长度分布
* Unigene长度分布
* Unigene 功能注释
* Unigene GO分类
* Unigene 表达差异分析（不少于两个样本）
* Unigene 在样本间的差异GO分类（不少于两个样本）
* Unigene 代谢通路分析
* 蛋白功能和分类预测
> 应用领域
* 全基因组EST测序
* 筛选SNV、SSR和InDel分子标记
* 基因表达谱研究
* 非编码RNA研究
六、 有参考基因组的转录组分析（Transcriptome analysis with reference genome）
> 测序和基本数据处理
合成双链Cdna 酶切去POLY-A 两端连接454接头 454测序 基本数据处理（图像识别、碱基识别、过滤接头序列、检测可能的样本污染）
> 生物信息分析内容
* 测序数据产量及与Reference比对结果概述
* Reads在基因组上的分布
* 测序随机性评估
* 基因覆盖度、测序深度的分布
* 基因差异表达分析
* 对基因结构进行优化
* 鉴定基因的可变剪切
* 预测新基因
> 应用领域
* 基因组注释
* 基因结构分析（可变剪接、基因边界等）
* 转录融合基因研究
* 基因表达谱研究
* 非编码RNA研究
八、 常见问题
（1） 是否可以进行原核生物转录组分析？
> 可以。请提供20 ug total RNA样品即可。
（2） 需要提供什么样本？
> 可以提供新鲜的动物、植物、微生物组织，提取后的总RNA或合成的双链cDNA均可。
（3） 实验周期多长？
> 美吉公司从获得客户样本、高通量测序到数据分析，根据合作伙伴的个性化需求不同，一般控制在30到40个工作日内完成。
（4） 需要多少测序量？
>
100万条有效序列，平均读长在300到500bp，聚类拼接后可以得到2到4万条Unigene，Unigene的平均大小在500bp到10Kb之间。转录组的大小受基因数目和基因丰度双重影响，在物种之间变化很大。此外，组织差异、状态和实验处理等因素也会影响转录组的组成。
（5） 是否可以参与实验和生物信息分析？
> 我们是开放式实验室，我们欢迎合作伙伴参与我们的实验过程和数据分析过程，在参与中增强沟通。
（6） 全长cDNA的判断
> 聚类拼接后的Unigene是否为全长cDNA, 需要进行判断。
> 直接从序列上可以从如下几个方面进行判断。
5′端:
* 有同源全长基因的比较, 通过与其它生物已有的对应基因末端进行Blast 来判断。
*
无同源基因的新基因, (1)判断编码框架是否完整, a.在开放阅读框架的第一个ATG 上游有同框架的终止密码,
需要注意的是有时真正的翻译起始密码子并非是出现在mRNA 中的第一个ATG, 在有的真核细胞中, 在起始密码子ATG
的上游非编码区会有可能出现一到几个ATG, 这称为非编码的5′ATG。以这种5′ATG 并不是真是的起始密码子,
以其开始的开放阅读框常常很快遇到终止密码子。b.无终止密码的则考虑有保守的Kozak序列; (2)判断是否自转录起始点, 有资料表明,
在5′帽结构后一般都有一段富含嘧啶的区域, 另外如果cDNA5′序列与基因组序列中经S1 酶切保护的部分相同, 则可以确定得到的cDNA
是全长的。
3′端:
* 有同源全长基因的比较, 方法同5′端;
* 编码框架的下游有终止密码;
* 有一个以上的polyA 加尾信号;
* 无明显加尾信号的则也有polyA 尾。
> 同源全长基因的比较可以用Blast 比对或多重序列比对软件来实现, 首先搜索到其他物种( 以相似性比较高的物种为宜) 该基因全长cDNA 序列,再将这些序列做Blast 或多重比对。
> 确定得到的cDNA 序列为全长的cDNA 序列还只是在计算机上的“虚拟克隆”, 最终还必须通过RT-RCR、序列测定和Northern 杂交等方法进行实验验证, 以保证序列的准确性。
