谷类植物种子蛋白质提取实验
实验材料 白蛋白球蛋白
试剂、试剂盒 提取液漂洗液溶解液烧化剂甘油溶液
实验步骤
3.1 种子总蛋白提取的普适方法
使用普适方法的目的在于从研磨好的种子中提取总蛋白质，不考虑具体的蛋白质种类 。此方法由 Damerval 等 [ 9] 及 Granier [ 10 ] 提出，它可以用于所有的种子，参见第 1 章 。
这种方法不仅特别适用于从绿熟种子中提取蛋白质，也适用于从早期形成阶段的谷类植物籽粒，种皮、胚或正在发育的胚乳中提取蛋白质。一些特殊组织，如糊粉层、胚和胚乳能够从发育中的籽粒及成熟的籽粒中分离出来。不像分离胚那样容易，分离糊粉层需要时间和经验，要在显微镜下剖开很多种子才能得到足够的材料用于蛋白质提取和双向电泳。
一株植物上收获到的种子存在差异，所以要从有代表性的穗、花序、荚等收集未成熟的种子。
根据所使用的方法，即在溶解之前沉淀（见下文）或直接溶解（见下文），在蛋白质提取量或者在双向电泳凝胶上的蛋白质图谱会有所不同。不管怎样，一旦应用了一个方法，整个实验就必须采用此方法的操作流程。
1. 在溶解之前沉淀
来自穗、花序、荚等的绿熟材料收集后立即称重。这些绿熟种子材料研磨之前冷冻。
( 1 ) 将研磨后的粉末（100 mg ) 立即加入 1 ml 预冷的 TCA/丙酮提取缓冲液（见注释 3~5) 。过夜沉淀后在 15000 g，4°C 离心 15 min。
( 2 ) 沉淀用漂洗液洗两次，每次洗后在 15000 g 4°C 离心 15 min。弃去上清（见注释 6) 。
( 3 ) 将从 100 mg 材料中得到的沉淀晾干，以去掉残留的丙酮，然后保存在 -80°C ( 见注释 7) 。这种方法可使蛋白质在被 1250 μl 溶解剂或者被含有如离液剂（chaotrope) 和去垢剂等特殊溶剂的 IEF 缓冲液溶解之前而高度浓缩。
2. 直接再溶解
种子中的蛋白质可以直接从研磨过的籽粒中提取，而不必先用 TCA/丙酮提取和沉淀 。用去垢剂和离液剂直接从天然组织中提取蛋白质比从沉淀中提取蛋白质更有效，而且这种方法可以防止蛋白质沉淀或者重悬不完全而造成的丢失。这里描述的方法不包含使用预冷丙酮进行的沉淀，尽管预冷丙酮在浓缩蛋白质及除去盐和其他有机化合物上很有用。这种丙酮沉淀方法直到最近才被提出 [11] 。另一种最近被报道的方法是从发育的小麦子粒中用 KCl 增进溶解的方法提取蛋白质 [ 12，13] 。大麦中的蛋白质首次用 5 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 及 1 mmol/L CaCl2 被提出 [ 14，15 ] 。含有各种蛋白酶抑制剂、DNA 酶Ⅰ、RNA 酶、Triton X-100 和 DTT 的硫脲/尿素裂解缓冲液被用于拟南芥种子。这里描述的方法主要适用于谷类植物胚乳蛋白的提取，这种蛋白质主要由贮藏蛋白（醇溶蛋白和谷蛋白）组成。这种方法不能排除其他蛋白质，特别是许多白蛋白和球蛋白也和贮藏蛋白一起被提取出来。
( 1 ) 材料在收集后要立即称重，然后碾碎（见注释 8 和注释 9 ) 或磨碎（见注释 10)。
( 2 ) 将 500 μl 溶解液加入已有 40 mg 材料粉末的离心管中，涡旋混合，在室温中孵育 1.5 h。
( 3 ) 超声处理（20W、20s ) 之后，将悬浊液放置 30 min 后离心（9000 g、5 min、20°C ) 。然后收集 250 μl 上清液。上清液主要含贮藏蛋白。
( 4 ) 用考马斯亮蓝法或 2D Quant 试剂盒测定蛋白质浓度。
( 5 ) 将 20 μl 载体两性电解质（根据 IEF 步骤中 IPG 条梯度要求选用）和 4 μl 4-乙烯基吡啶（见注释 11 ) 加入到 250 μl 上清液中。涡旋混合 15 min，再加入 254 μl 甘油溶液。-80°C 保存直到使用。
3.2 特定蛋白质的提取
1. 白蛋白和球蛋白
同时提取两种蛋白质（水溶性白蛋白和盐溶性球蛋白）已经优化应用于等电聚焦。
因此，用磷酸钠缓冲液提取蛋白质后 [ 18 ] 得到的蛋白质先脱盐、沉淀，然后重悬于等电聚焦缓冲液中。最近，用这种方法在双向电泳中成功分离小麦籽粒中的白蛋白和球蛋白 [ 19 ] 。根据 3. 3.1 节 2 中描述的方法或是在注释 8~10 中描述的方法碾磨种子（包括种皮、带胚或不带胚)。蛋白质提取根据以下步骤完成。
( 1 ) 将 100 mg 材料粉末加入 1 ml 磷酸钠缓冲液中，在 4°C 持续搅拌 2 h。离心 ( 8000 g、10 min、4°C ) ，然后取 500 μl 上清液（见注释 13 )。
( 2 ) 根据生产商说明，用冷水在 4°C 透析 24 h ( 见注释 14)。
( 3 ) 除去盐分的样液与 1 ml 丙酮混合，在 -20°C 反应沉淀一夜，然后离心（8000 g 4°C、5 min) 。
( 4 ) 除去上清液，将蛋白质沉淀用预冷丙酮漂洗 3 次，每次漂洗后离心（8000 g 4°C、5 min) 。沉淀蛋白质风干后除去残留的丙酮。
( 5 ) 将沉淀溶于 250 μl 溶解缓冲液中，其间涡旋几次（见 3.2.1) 。室温下 1.5 h 后，溶解的蛋白质再用超声处理（20 W、20 s ) ，将悬浊液静置 30 min，离心（9000 g、5 min、20℃），收集上清液。
( 6 ) 收集含有蛋白质的上清液，并补充 20 μl 载体两性电解质和 4 μl 4-乙烯基吡啶。溶液进行涡旋处理，静置 15 min。
( 7 ) 加入 254 μl 甘油。溶液在进行双向电泳分析之前，一直保存在 -80°C ( 见注释 12 ) 。
2. 两性蛋白质
这种蛋白质由两种形式的氨基酸序列组成，一种序列富含亲水的氨基酸（大部分为 Lys 、Arg 和 His) ，另一种序列富含疏水的氨基酸（如 Val、Leu 和 lie ) 。大部分膜蛋白都是两性的。这里描述提取方法基于与其他方法做适当改良 [ 20] ，便于从小麦种子中提取两性蛋白质 [ 21，22] 。
( 1 ) 籽粒按照前述方法研磨（见注释 8~10)。
( 2 ) 取 250 mg 粉末加于 7.5 ml Triton X-114 溶液中，在 4°C 搅拌 1 h，并在 10000 g，4°C 离心 30 min。
( 3 ) 上清液在 37°C 加热 45 min 进行相分配，然后在 5000 g、22°C 离心 10 min。小心除去上层轻相（见注释 15)。
( 4 ) 将 5 体积沉淀液（大约 10 ml) 加入富含两性蛋白质下层相。在 -20°C 沉淀过夜。
( 5 ) 在 2000 g，-8°C 条件下离心 10 min 后，沉淀用 10 ml 二乙醚乙醇溶液漂洗 3 次，每次漂洗后在 2000 g，-8°C 条件下离心 10 min。
( 6 ) 最后，沉淀用 5 ml 二乙醚漂洗、离心，在室温下真空干燥。干燥后的沉淀保存在 -80°C 备用。等电聚焦时，将干燥的沉淀溶解于 250 μl 溶解液中（见 3.2.1 )。
3. 淀粉粒蛋白质
淀粉是谷类植物籽粒胚乳中的主要成分（占干重的 70%~75% ) 。源于造粉体的淀粉粒随着种子的形成在成熟的胚乳中积累。在谷类植物种子中，淀粉粒大小分布不同 ( 图 3-1)。以下介绍的方法用于提取谷类植物子粒中吸附在淀粉粒上或存在于淀粉粒中的蛋白质。这种方法是在关于小麦淀粉中的淀粉合酶研究的基础上修改形成的 [ 23,24] 。
( 1 ) 在室温条件下，用研钵和杵捣碎 1~2 个半籽粒，并将磨碎的组织从种皮组织中分离出来（见注释 16)。
( 2 ) 将 40~60 mg 粉末在 1 ml 去离子水中 4°C 浸泡过夜。将悬浊液在 10000 g，4°C 离心 2 min。
( 3 ) 然后将 300 μl 冷水加入沉淀上，并涡旋混合。
( 4 ) 悬浊液中加入 1 ml 90%（V/V）CsCl 进行分层，在 4℃ 静置 5 min，然后在 14000 g，4°C 离心 5 min。小心除去上清液。
( 5 ) 然后把 1 ml 含有 CHAPS 和 DTT 的漂洗液加在沉淀上。涡旋混合，在 37°C 加热 15 min，并每隔 5 min 涡旋一次。悬浊液在 14000 g，4°C 离心 3 min，小心除去上清液。
( 6 ) 将淀粉粒沉淀离心（参数同前）并用水漂洗 3 次，方法如下：加 1 ml 水在沉淀上，涡旋悬浊液，室温静置 5 min，然后在 14000 g 4°C 离心 3 min。每次都小心除去上清液。
( 7 ) 最后用预冷丙酮漂洗 5 min，涡旋，离心同步骤（6) 。晾干淀粉粒沉淀，称重，并保存在 -20℃ 备用。
( 8 ) 以 1 : 5 ( m/V ) 的比率用漂洗液重悬淀粉粒沉淀。通常，40 mg 干燥淀粉沉淀可在室温下，涡旋悬浮于 200 μl 新配制的含有 4% ( m/V ) CHAPS 和 2%（m/V ) DTT 的溶液中（见注释 16)。将悬浮液静置 5 min，100°C 加热 5 min，可使淀粉粒释放其内含物。
( 9 ) 将悬浊液在冰中冷却 10 min，并在 17000 g，4°C 离心 15 min。上清液中含有强力吸附于淀粉粒上或存在于淀粉粒中的蛋白质。收集的蛋白质可以被保存在 -80°C 或直接用于双向电泳。在进行等电聚焦时，需要将 150 μl 的溶解液（见 3.2.1 ) 加入到 100 μl 上清液中。
