细胞转染实验的步骤介绍
一、细胞传代
(1)试验准备:200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌),酒精棉球,废液缸,试管架,微量移液器,记号笔,培养皿,离心管。
(2)弃掉培养皿中的培养基,用1ml的PBS溶液洗涤两次。
(3)用Tip头加入1mlTrypsin液,消化1分钟(37。C,5%CO2)。用手轻拍培养瓶壁,观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。
(4)加入1ml的含血清培养基终止反应。
(5)用Tip头多次吹吸,使细胞完全分散开。
(6)将培养液装入离心管中,1000rpm离心5min。
(7)用培养液重悬细胞,细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。
(8)将合适体积完全培养液加入离心管中,混匀细胞后轻轻加入培养皿中,使其均匀分布。
(9)将培养皿转入CO2培养箱中培养,第二天转染。
二、细胞转染
1)转染试剂的准备
A.将400ul去核酸酶水加入管中,震荡10秒钟,溶解脂状物。
B.震荡后将试剂放在-20摄氏度保存,使用前还需震荡。
2)选择合适的混合比例(1:1-1:2/脂质体体积:DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA,震荡后在加入合适体积的转染试剂,再次震荡。
5)将混合液在室温放置10—15分钟。
6)吸去培养板中的培养基,用PBS或者无血清培养基清洗一次。
7)加入混合液,将细胞放回培养箱中培养一个小时。
8)到时后,根据细胞种类决定是否移除混合液,之后加入完全培养基继续培养24-48小时。
三、第二次细胞传代
1) 在转染后24小时,观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。
2) 再次进行细胞传代,按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新放入培养皿中。
3) 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。