原代细胞转染小核酸siRNA等操作步骤和注意事项
原代细胞相对普通传代细胞要难转染，但用对了试剂一样可以拥有很高的转染效率和实验结果，下面以RFect为例，简单介绍下原代细胞转染的操作步骤和注意事项。
原代细胞转染操作步骤（以24孔培养板为例）：
A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔500 μl培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50%。
B. siRNA-RFectPM混合物准备：
1.6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。
2.2μl RFectPM用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。
3.孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFectPM稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。
C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：
将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。
2.37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。
转染实验优化: 为了提高转染效率，最好对转染条件进行优化，特别是首次使用。例如：24孔培养板，调整 siRNA与RFectPM试剂的用量。siRNA用量在0.6-30 pmol (final concentration 1- 50 nM)之间调整，RFectPM试剂用量在1.0 - 3.0μl之间调整。
原代细胞转染实验要点：
转染过程不可添加抗生素，否则会导致细胞死亡；
首次实验siRNA的用量设置在终浓度10nM、30nM、50nM、100 nM进行摸索 ，后续实验根据实验结果修改。
RFectPM可用来转染siRNA、antisense RNA、microRNA等200bp以内的小分子RNA和DNA，可转染绝大多数原代细胞。对于大多数原代细胞，RFectPM的细胞转染阳性率都在80%以上，而转染细胞死亡率不到10%。RFectPM的使用也极其简便，先将sRNA与RFectPM室温混合，再将siRNA-RFectPM混合物直接加入含培养基的细胞，血清对转染效果没有影响，不必刻意添加或更换培养液。
使用RFect 系列小核酸转染试剂做siRNA/miRNA转染测实验注意事项：
细胞接种：一般做转染前一天接种/铺板（细胞计数大约5*10^4cell/ml），使做转染前细胞密度在30-50%；如果细胞是原代细胞，接种密度可以密一些，细胞计数在2*10^6cell/ml；悬浮细胞可以在转染当天接种/铺板（细胞计数大约5*10^4cell/ml），待细胞状态稳定后做转染前细胞密度30-40%。
2.为了能在使用时有较好的转染效果，第一次使用建议您用24孔板做，每孔2ul转染试剂即可。将最佳转染条件（siRNA与转染试剂的用量、比例）放大到对应的孔板即可。
3.设置siRNA终浓度10nM,30nM,50nM,100nM四个梯度，每个梯度最好做2-3个复孔（至少2个复孔，避免实验误差）。
4.用来稀释siRNA和稀释转染试剂的培养基必须是无血清培养基，因为血清的存在会干扰siRNA与转染试剂的混合，并且影响转染效率。
5.检测方法：转染后48h收细胞做qPCR基因水平检测或者转染后72h收细胞提蛋白做western Blotting蛋白水平检测。
