Western Blot 相关技术操作与原理-1
【实验原理】： Western Blot 印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白质样品通
过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，最后用ECL超敏发光液试剂检测。如果转印膜上含有靶蛋白，经X 光片曝光、 显影后，则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。
Western blot 实验分为三个部分：
1． 样品蛋白质的制备、 蛋白质含量测定 2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
3． 凝胶转膜及其检测
以提取细胞蛋白为例Western 印记杂交实验流程图：
提取细胞总蛋白、测定含量
↓
制备SDS-PAGE 胶
↓
蛋白样品变性、电泳
↓
电泳转膜
↓
封闭
↓
一抗
↓
TBST 洗涤
↓
HRP 标记的二抗
↓
TBST 洗涤
↓
ECL 试剂作用
↓
X-光片曝光、显影
↓
结果分析
细胞总蛋白的提取及含量测定
一、细胞总蛋白的提取
提取细胞蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理。提取蛋白质的方法很
多。其目的都是要获取高丰度、高品质的蛋白质,以满足实验需要。
在提取蛋白质实验中要特别考虑到细胞裂解液的pH、去污剂的类型和浓度以及二价阳
离子、辅助因子等因素，同时为防止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解，需在裂解液中加入蛋白
酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的种类很多，如PMSF(苯甲基磺酰氟)；金属蛋白酶抑制剂乙二胺
四乙酸（EDTA）、乙二醇双四乙酸（EGTA）；肽蛋白酶抑制剂：亮抑酶肽（leupeptin）、胃蛋白酶抑制剂A（pepstatin A）、抑蛋白酶肽（aprotinin）；甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（TLCK）、
甲苯磺酰丙氨酰氯甲酮（TPCK）等，要根据具体情况具体选择。
制备蛋白质样品应遵循下述原则：
1．尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。
2．细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋
白酶的降解。
3．样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于-80℃。切勿反复冻融已制备好的样品。
（一）试剂
1．细胞总蛋白裂解缓冲液：
蛋白抽提试剂盒-I (实体组织和细胞蛋白抽提,)
2．PMSF 储存液(100mmol/L)： 称取PMSF 17.4mg，溶于1ml 异丙醇，分装后储存于
-20℃。
注意:
PMSF(苯甲基磺酰氟)在水溶液中不稳定，故应在临用前再加入到细胞裂解缓冲
液中， 使其终浓度为0.174mg/ml，如：1 ml 细胞裂解液中，加入10ul PMSF 储存液.
（二） 仪器和耗材 冷冻离心机
无菌的Tip 头、1.5ml 及0.5ml 离心管 ，
（三） 实验材料 Hela 细胞
（四） 实验步骤
1．细胞的预处理：
由37℃ CO2 培养箱中取出于60mm 细胞培养皿中培养的Hela 细胞，（细胞数约为5
×106 ），吸弃原培养液，用4℃预冷的1×PBS 洗细胞表面3～4次，以去除培养基中的血清
及死细胞，并尽量吸弃细胞培养皿中残余的PBS。将洗涤后细胞直接冻存于-80℃冰箱，待
提取蛋白质。此方法可保存细胞至少两周。（注：如果需要，当用PBS 洗涤细胞后，不必-80℃冰箱冻存，可直接进行步骤2）
2．（由-80℃冰箱中取出细胞培养皿，将其置于冰上，） 向上述各培养皿中加100ul 含
PMSF 的蛋白提取液，轻轻晃动，使裂解液均匀铺于细胞表面。
3．冰浴40 分钟（通常冰浴时间为30～60 min），期间晃动3-4 次培养皿，使其作用均
匀。
4．用Tip 头集中蛋白提取液，将其收集入冰上预冷的1.5ml Ep 管中，4℃离心，12,000g
× 20min。
5．将上清液小心移入预冷的0.5ml 离心管中（为避免反复冻融导致蛋白降解，可按需
要将其分装使用），-80℃保存备用。
（五）操作注意事项
1．注意个人防护。PMSF 严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸
收有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，立即用大量水冲洗
2．所用离心机需提前预冷。
3．吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。
二、细胞总蛋白含量测定：
蛋白质的定量，目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、BCA法、Lowry法（Folin-酚试剂法）等。但各有优缺点，客户可以根据具体情况选取。
本实验仅以Bradford 方法为例。
㈠ 试剂
1. 4mg/ml BSA 标准蛋白液：10μl/管，4℃保存。临用前，
加入70μl 生理盐水，配制成0.5mg/ml。
2. 5×Bradford 试剂
3．考马斯亮蓝G-250 使用液
a. 考马斯亮蓝G-250 母液： 称取考马斯亮蓝G-250 100mg,溶于50ml 95%乙醇；加入
100ml 85%浓磷酸(w/v)。过滤，4℃保存6 个月。
b. 考马斯亮蓝G-250 使用液（ 0.01%考马斯亮蓝G-250）：
取考马斯亮蓝G-250 母液 15ml加蒸馏水稀释至 85ml(临用前稀释 )
㈡ 仪器 分光光度计及玻璃比色皿
㈢ 实验步骤
1. 稀释5×Bradford 试剂：如欲配制15ml 考马斯亮蓝使用液, 则：5×Bradford 试
剂3ml, 蒸馏水12ml, 充分混合；
2． 稀释BSA 标准品及制作标准曲线：
用生理盐水或PBS 将0.5mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）标准蛋白液分别稀释成0、2、4、
6、8、10ug/100ul(分别编号：1、2、3、4、5、6、)浓度；
3．向上述不同浓度BSA 管中分别加入1.5ml Bradford 使用液， 混合均匀后移至玻璃
比色皿中，于紫外分光光度计上测定595nm 吸光度值（OD595），依据所得数据制作标准曲线；
4．稀释待测蛋白样品：
吸取细胞总蛋白样品2 ul，加入98ul 生理盐水或PBS（总体积为100ul），混合均匀后
加入1.5ml 考马斯亮蓝使用液，混匀后测定595nm 吸光度值（OD595）；
5．计算样品总蛋白含量（ug/ul）：
根据标准曲线图，找出样品蛋白在图中的位置，计算出蛋白含量。
（四） 注意事项
1．制作的BSA 标准曲线如不规律，应重新再做。
2． 如果待测样品浓度高（如组织提取物），可用生理盐水稀释10～20 倍后测定；如样
品浓度低，可适当增加样品ul 数及减少生理盐水或PBS 的ul 数
3． 比色皿的清洁： 考马斯亮蓝不易被清水冲洗干净，因此使用后的比色皿除用清水
冲洗后，还需用无水乙醇将比色皿浸泡数分钟以脱色，而后分别用自来水、蒸馏水冲洗后备
用。
SDS-聚丙
