mRNA工艺技术平台之mRNA制剂
mRNA疫苗或药物的生产工艺，主要分为质粒DNA原液制备、mRNA原液制备、mRNA制剂制备三个阶段。本文讨论第三阶段的工艺平台，也是当前挑战最大的环节。
关键的制剂技术突破解决了mRNA的成药性问题，使其从60年的科研之路走向临床商业化应用，并在此次新冠疫苗应用中大放异彩。据公开信息， BNT162b2和mRNA-1273 2021年累计销售额超过580亿美元。
mRNA制剂的主要工艺环节包括mRNA的包封/装载、复合物纯化、除菌过滤、无菌灌装等，如下图。整个制剂工艺的核心挑战在于递送系统的选择以及mRNA的包封/装载，其余步骤采用的是现有成熟工艺。以当前最主流的脂质纳米颗粒(LNP)载体为例，仅ZL相关问题，就足够头疼。
▲ mRNA制剂生产工艺流程
1 mRNA原液复融
如果mRNA原液经冷冻储存或运输，那么其复融工艺是不容忽视的。具体原因和可用复融设备与质粒DNA原液复融类似。需要注意的是，mRNA分子的稳定性要远低于质粒DNA，复融过程中需要注意避免重结晶。
2 mRNA包封/装载
包封/装载工艺的基础是递送系统的设计开发。良好设计的递送系统才能使mRNA分子进入人体后避免被RNA酶降解、被有效递送至靶点、穿过细胞膜并在胞内释放。目前主流是采用非病毒递送系统，包括基于脂质的递送系统（如核酸脂质体复合物(lipolexes)、阳离子脂质体）、基于聚合物的递送系统（如polyplexes）、基于脂质和聚合物的递送系统（如lipopolyplexes）等。
以目前主流的LNP为例，其直径约100 nm，由多种脂质成分组成。Moderna公布的脂质成分包括可电离阳离子磷脂：中性辅助磷脂：胆固醇：PEG修饰磷脂，摩尔比为50:10:38.5:1.5。如下图，mRNA（红色）与离子化的脂质分子带正电荷的末端结合形成复合物，脂质的疏水端向外与辅助脂质（蓝色、绿色、黄色）疏水端结合，形成稳定的脂质双分子层结构。
▲ LNP的成分及mRNA包封结构
mRNA-LNP包封制备的关键，除了脂质成分配方外，就是工艺过程的控制了，即如何控制mRNA与脂质成分的接触和相互作用过程，以形成稳定、均一、收率高的mRNA-LNP复合物。公开报道的LNP制备方法有超声波、剪切、均质（高压&微射流）、挤出等。
Pfizer/BioNTech采用的是碰撞喷射混合器 (IJM) ，能够配制和生产带有 API 的高质量脂质纳米颗粒（例如用于 mRNA 疫苗）。 活性药物成分与脂质的封装过程基于碰撞喷射混合技术，其中两股流在碰撞喷射混合室中高速碰撞。一个流包含有机溶剂中的脂质，另一流包含水中的 API 高速混合会降低脂质的溶解度，从而形成均匀的纳米颗粒。 纳米粒子的质量取决于流的流动稳定性、混合器几何形状和流体速度。作为最后一步，混合物被稀释防止颗粒聚集。
▲ KNAUER 冲击式射流混合器
▲ KNAUER LNP包封设备
不同的厂家可能采用不同的微流控混合/挤出技术，尤其是微流道的设计，但通过两相混合形成包封复合物这一原理是一致的。影响最终产品质量的因素除了两相溶液自身成分特性、具体微流控混合/挤出技术外，还包括两相溶液的注入温度、压力、流量、比率等。
▲ PreciGenome 两相混合包封技术
▲ PNI NxGen混合包封技术
Pfizer/BioNTech采用的是碰撞喷射混合器 (IJM），该设备较传统微流控设备通量大，更适合中试以及生产过程，完善的GMP要求相关文件，无一次性耗材等优点，使得大规模生产变为可能。目前KNAUER已推出实验室级别设备-IJM NanoScaler，更多信息可联系绿绵科技15201316651（微信同号）。
3 超滤纯化
mRNA包封后需要纯化去除未包封/装载的mRNA、游离的聚合物或脂质材料，并调整最终复合物浓度、置换溶剂缓冲体系、调节pH值等，此步骤通常通过超滤/切向流过滤实现，mRNA-LNP复合物被截留，杂质及溶剂被洗滤。
超滤工艺为成熟技术，可选中空纤维或板式膜包，最关键的还是根据mRNA-LNP复合物的粒径选择合适的截留孔径。根据最终制剂成品的配方要求，纯化后的mRNA-LNP溶液可能还需要进行制剂配液，添加必要的辅料成分，以利于产品的长期稳定保存和体内药效发挥。超滤和配液相关的设备耗材品牌可见前两篇。
4 除菌过滤
此步除菌过滤是最终产品无菌保障的关键，一般采用0.22μm除菌级过滤器冗余设置，截留细菌等微生物污染物。按照当前的法规要求，必须要进行使用后滤器完整性检测以确保最终产品的无菌性。
除菌过滤为现有成熟技术，可用一次性囊式滤器或套筒式滤器，常见材质有聚醚砜（PES）、聚偏二氟乙烯（PVDF）等。在选择时重点关注材质与产品的兼容性、溶出析出特性、通量及通量的衰减等。常用除菌过滤器品牌可见前两篇。
5 无菌灌装
对于无菌注射剂产品，灌装技术需根据产品包装容器来选择。以mRNA疫苗所用西林瓶为例，无菌灌装过程包括容器和胶塞的准备、灌装、加塞、轧盖、灯检等步骤。
西林瓶的准备步骤主要是洗瓶、干燥和除菌除热原，大规模生产时，行业常用洗烘灌联动线进行连续化生产。胶塞的准备过程主要是清洗和灭菌，可以在生产前采用清洗机和灭菌柜进行准备或直接采用免洗免灭菌的无热原胶塞。
▲ 自动化连续无菌灌装加塞
由于灌装过程为开放式操作，无菌污染的控制是最为关键的，要考虑到人员、设备、物料、环境和操作方法等方面，如无菌灌装、加塞及产品未完全密封时的转移等操作均需要在A级环境进行。
灌装线常见的品牌包括Syntegon, B+S, IMA, Optima, Romaco/楚天, ROTA/奥星, 东富龙等。随着一次性使用系统的广泛应用，灌装机厂家开始与耗材厂家合作推出一次性灌装系统，如Syntegon与Sartorius推出的PreVAS, 一次性使用耗材厂家也能提供灌装耗材定制服务，如Pall, Merck, Avantor, Meissner, 乐纯等。
6 包装储存运输
完成灌装和质检的mRNA制剂产品，根据储存运输要求被冷冻至储存温度，之后完成运输包装以便于全球流通。对于需要冷冻储存的mRNA产品，有必要在储存和运输过程进行持续的温度监测，以证明其始终处于规定的储存温度范围，否则不能保证最终患者给药时产品的安全性和有效性。
▲ mRNA疫苗成品进行冷冻储存
写在最后
虽然mRNA新冠疫苗仍是当前唯一上市的mRNA产品，然而理论上通过mRNA可以编码任何人类需要的蛋白，不论是作为疫苗还是治疗性药物。Moderna公开的在研管线就包括了预防性疫苗、全身性细胞内治疗、局部再生疗法、全身性分泌和细胞表面治疗、癌症疫苗、肿瘤内免疫肿瘤治疗等。
据 Nature 2021年9月份的综述预测，mRNA新冠疫苗在mRNA药物市场的占比将随着更多mRNA产品获批上市而逐年下降，10年后将低于50%，更多mRNA产品将得以应用。
▲ mRNA产品市场演变预测
我国《“十四五”医药工业发展规划》明确提出加快核酸疫苗技术平台建立，推动相关产品的开发和产业化，支持疫苗企业和重要原辅料、耗材、生产设备、包装材料企业协作，提高各类产品质量技术水平。可见mRNA技术平台是一定要突破的。
整个mRNA制剂工艺流程中，核心挑战在于递送系统的设计和包封工艺，其余部分采用的是现有成熟技术。由于mRNA递送技术当前仍处于不断摸索和更新中，未来仍有很多可变性和提升空间，目前仍很难将其称作平台工艺，相信随着更多研究和应用数据的积累，递送技术平台将逐步完善。另一方面，mRNA-LNP配方体系仍需要优化以提升制剂产品的稳定性，降低对冷冻储存和运输的要求，从而更利于mRNA产品的流通和临床应用。
此文对mRNA制剂工艺平台进行梳理的目的，在于让同行更为了解整个工艺平台及现有资源，以便于提升自身的工作效率；同时，让更多同行了解国内与国际品牌在工艺平台能力上的差距，看到努力的方向。
文章内容仅基于笔者的知识经验、信息梳理和总结，可能存在错误或疏漏，还请广大读者批评指正，欢迎留言评论更正或补充，感谢！
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注：部分参考信息、图片和视频来源于网络。
参考文献
药品审评中心, 新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）, 2020年8月.
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Cross, R. Withoutthese lipid shells, there would be no mRNA vaccines for COVID-19. C&EN2021, 99. https://cen.acs.org/magazine/99/09908.html
Aldosari et al. LipidNanoparticles as Delivery Systems for RNA-Based Vaccines. Pharmaceutics, 2021. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13020206
Xie W, Chen B, WongJ. Evolution of the market for mRNA technology.Nature Review Drug Discovery.2021 20(10): 735-736. doi: 10.1038/d41573-021-00147-y.
