详细解读：mRNA帽子结构的生物学功能与应用
信使核糖核酸（mRNA）的5’端帽子结构（Five-prime cap）（m7GpppN）是在 1970 年代被发现的，它的存在赋予了mRNA稳定性并使其能够有效翻译。随着COVID-19在全球肆虐，mRNA治疗成为生物医药研发领域中的”新星“，我们对mRNA 5’端帽子结构的生物功能及其应用有了更深入地探索。
在真核细胞中，除了识别蛋白质合成的起始之外，5’端帽子结构还充当从5’到3’外切核酸酶切割的保护基团，同时也是募集蛋白质因子以进行前体mRNA 剪接、聚腺苷酸化和核输出的唯一标识符，它也充当募集起始因子的锚点。
甚至，在病毒与固有免a疫的博弈中5’端帽子结构也极为重要。因为固有免疫系统对没有 5 ’端帽子结构的 RNA 具有较高的敏锐度，因此很多病毒进化出了丰富多样的加帽策略。而对这些病毒mRNA的加帽机制研究，已拓展出诸如高效体外RNA 加帽系统和自扩增 mRNA 技术，大大促进了科研型与治疗型 mRNA 的大规模生产。另外，RNA 加帽酶的应用也使微生物转录组的测序和量化成为可能。
图1. mRNA的分子生物学结构
mRNA是指导蛋白质合成的模板，是一种遗传物质的临时副本，具有拷贝少、寿命短、修饰成分少的特点。成熟的真核生物mRNA的主体序列是编码区（图1），上游5’ 侧和下游3’侧的非编码区分别包含帽子结构与poly(A)尾结构（图2）。
真核生物的mRNA加帽过程需要多种加帽酶的参与。如图3所示，RNA三磷酸酶（TPase）从5’-三磷酸中去除 γ-磷酸，生成 5’-二磷酸 RNA（反应 1）。RNA 鸟苷酸转移酶（GTase）通过赖氨酸-GMP 共价中间体将 GMP 基团从 GTP 转移到 5’-二磷酸（反应 2.1 和 2.2）。嘌呤-N7 甲基转移酶（鸟嘌呤-N7 MTase）在鸟嘌呤帽的N7胺上添加一个甲基，形成基本帽结构（Cap0）（反应 3）。
此外，m7G 特异性 2’O-甲基转移酶（mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase）还可将核糖2’O位置的核糖核苷酸甲基化生成Cap1结构（反应 4）。最近的研究表明，Cap1不仅与翻译起始有关，在针对外源RNA的先天免疫系统中，还可作为自身RNA的标志。
图2. 真核生物中，mRNA的帽子结构类型
图3. 真核生物中mRNA加帽过程
5’端帽子结构对mRNA的质量控制有着至关重要的作用。在哺乳动物细胞中，已经报道存在一种具有脱帽酶、焦磷酸水解酶和 5’ 到 3’核酸酶活性的三功能蛋白DXO/Dom3Z。该酶特异性地将未甲基化的帽子结构（GpppN）进行脱帽处理并将其降解为5’-单磷酸RNA，从而达到质量控制的目的。
5’端帽子结构有助于调节蛋白质合成。早期认为RNA加帽只发生在细胞核中，已有报道在哺乳动物细胞和锥虫的细胞质中发现了RNA 加帽。真核细胞在P-小体中以信使核糖核蛋白（mRNP）的形式维持未加帽结构的mRNA 细胞质池，在那里可以发生 mRNA 的储存、去腺苷酸化和脱帽。P-小体中未加帽的mRNA可以重新进入多核糖体（polysome）并被翻译。细胞质重新加帽子结构的系统可能代表了一种新的mRNA 失活-再激活机制，有助于调节蛋白质合成。
鉴于RNA帽子结构在蛋白质翻译和固有免疫中有重要作用，病毒已经进化出RNA添加帽子结构的生物学系统，用于合成病毒蛋白质和逃避宿主细胞的固有免疫系统。由于大部分细胞中RNA加帽的场所在细胞核中，因此在细胞质中复制的病毒会产生自己的RNA帽子结构。它们是通过合成自己的RNA帽子结构或直接从宿主的mRNA中夺取。
一些病毒加帽酶整合了RNA加帽所有必要酶活性（多功能加帽酶），以在单个多肽中生成Cap0或Cap1。痘病毒加帽酶和蓝舌病病毒加帽酶就是这样两个例子，它们的全长蛋白质结构已经被解析（图4）：
图4. 痘病毒加帽酶和蓝舌病毒加帽酶结构
痘病毒加帽酶结构和生化数据表明，D12与鸟嘌呤-N7 MTase 结构域的相互作用会诱导有效催化所需的构象变化。痘病毒加帽酶的三种酶活性从N-端到C-端按照TPase、GTase和鸟嘌呤-N7 MTase的顺序整齐排列为离散模块。蓝舌病毒加帽酶VP4 整合了所有4种酶活性以生成Cap1结构。
病毒除了合成自身的帽子结构，也存在夺取宿主mRNA帽子结构的情况（图5），在流感病毒（（-）ssRNA）中，依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp）是三种蛋白质的复合物：聚合酶基础蛋白1（PB1）、聚合酶基础蛋白2（PB2）和聚合酶酸性蛋白（PA）。
在细胞核中组装后，PB2 亚基与宿主RNA 的帽子结构结合。PA的核酸内切酶将切割宿主mRNA的含帽子结构在内的10-15个核苷酸，然后将其用于病毒的mRNA转录上。在酵母全病毒中Gag蛋白从宿主RNA上切割 m7GMP 基团并形成组氨酰-m7GMP共价中间体。然后将 m7GMP 基团共转录转移到病毒转录本的 5’-二磷酸上。该过程与经典 GTase活性的相似性表明全病毒帽子结构与真核生物加帽机制之间存在进化联系。
图5. 病毒直接获取宿主的帽子结构
病毒由于其特殊的添加mRNA帽子的方式而得到关注，人们也发现其RNA加帽酶具广泛的应用价值：
1. 外源mRNA技术
作为蛋白质合成的模板，将mRNA导入细胞是驱动细胞内靶蛋白表达最直观的方式。外源性mRNA在干细胞重编程、疫苗接种和治疗性蛋白质的表达中起到举足轻重的地位。
2. 功能性mRNA的酶促合成
为避免携带动物或病毒材料，最好在体外使用无动物来源材料以酶促方式制造治疗性RNA。通常，DNA依赖性RNA聚合酶将含有启动子的DNA模板转录成RNA。RNA的酶促加帽通常使用痘病毒加帽酶进行，允许对RNA进行完全加帽，产生带有Cap0的RNA。
在固有免疫反应最小化的应用中，可以使用帽特异性2’O-甲基转移酶将Cap0结构进一步修饰为Cap1。在转录中分别使用m5CTP 和假尿苷三磷酸代替CTP和UTP已被证明可以减少TLR诱导的免疫反应。
3. mRNA疫苗
与传统的减毒活完整生物体相比，通过mRNA接种进行疫苗接种具有许多积极的属性。mRNA疫苗不仅不会对载体产生免疫反应，是可以同时刺激固有免疫和体液免疫的有效手段。制造很简单，一旦获得致病因子的基因组序列，就可以迅速做出反应。与DNA疫苗不同，抗原产生的反应时间更快、更有效，因为mRNA疫苗可以直接在细胞质中翻译。也无需担心潜在的基因组整合。
4. 自扩增mRNA
利用甲病毒的RNA转录加帽装置，已开发出一种自扩增mRNA 技术作为疫苗接种的原位基因表达载体。甲病毒有一个（+）ssRNA 基因组，编码非结构性前体蛋白nsp1-4，用于RNA依赖性RNA复制、转录和加帽，以及两个衣壳蛋白E2和E1。
通过用目标基因替换衣壳蛋白基因，加帽和聚腺苷酸化的自扩增RNA 构建体在引发免疫反应方面比通过标准mRNA接种疫苗更有效，并且已经在动物模型中证明有效。
5. Cappable-Seq RNA测序
痘病毒加帽酶能够使用3’修饰的GTP为RNA添加帽子结构。从而出现了一种基于这种功能的从生物样品中富集和测定5’-三磷酸RNA 种类的新方法。称为Cappable-seq，痘病毒加帽酶用于使用3’-脱硫生物素GTP 将生物样品中RNA的5’-三磷酸或二磷酸末端加帽。然后可以对脱硫生物素化的加帽RNA进行富集和深度测序。
Cappable-seq实现了50倍于初级转录本的富集，并在大肠杆菌中以单碱基分辨率在全基因组范围内识别了以前未报告的转录起始位点（TSS）。该方法还被应用于从小鼠盲肠样本中鉴定微生物组转录组，并首次在微生物组中鉴定出TSS。
目前现有的加帽方法:
1.酶学法mRNA加帽
牛痘病毒加帽酶将 7-甲基鸟苷帽结构（m7Gppp，Cap0）加到 RNA 的 5´ 末端。在真核生物中，该结构与 mRNA 的稳定、转运和翻译密切相关。这种系统通常含三种酶（RNA 三磷酸酶，鸟嘌呤转移酶，鸟嘌呤甲基转移酶）；都为加入完整 Cap 0 结构 m7Gppp5’N 所必需。近岸蛋白生产的加帽酶可用于 T7 RNA Polymerase, GMP Grade（GMP-E121，Novoprotein）反应产生的 RNA 的加帽反应，加帽反应在一小时之内完成，加帽效率接近 100％，并且所有帽结构均以正确的方向添加，这与共转录法添加帽类似物不同。
2.帽结构类似物共转录加帽
抗-反帽结构类似物（ARCA）[抗-反帽结构类似物 3’-O-Me-m7G（5’） ppp（5’）G] 是用于共转录加帽的首选帽结构类似物。由于 ARCA 进行共转录时为定向整合，N7-甲基鸟苷位于 [m7G（5’）pppG-RNA] 末端，因此能够产生 100％ 可翻译的带帽转录本。
而标准帽结构类似物 [标准帽结构类似物 m7G（5’）ppp（5’） G] 能够以两种方向整合[m7G（5’）pppG-RNA]或[G（5 ’） pppm7G-RNA]，产生转录本为混合物。如果帽结构类似物以错误的方向掺入 mRNA 则无法有效翻译，从而导致目标蛋白产量低。如果 RNA 产物为 5’-加帽和 5’-三磷酸的混合转录产物，则需要将其进行纯化或使用磷酸酶处理，以避免 5’-三磷酸 RNA 产生的免疫原性。
3.Cap 1 修饰
已有研究表明 cap 1 结构能够增强 mRNA 的翻译效率，从而提高 mRNA 在转染和显微注射实验中的表达。以近岸蛋白为例，其Cap 1 Capping System可利用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，使加帽的 RNA（cap 0）甲基化，获得 cap 1 结构。
综上所述，mRNA的帽子结构与RNA质量控制和机体固有免疫有重要联系，与此同时，与加帽有关的病毒加帽相关酶类也得到人们重视。加帽酶在外源mRNA技术、功能性mRNA的酶促合成、mRNA疫苗、自扩增mRNA和Cappable-Seq RNA测序方面都有较好的应用前景。
参考文献：AnandRamanathan, G. Brett Robb, Siu-Hong Chan, mRNA capping: biological functions and applications, Nucleic Acids Research, Volume 44, Issue 16, 19 September 2016, Pages 7511–7526, https://doi.org/10.1093/nar/gkw551
文章来源：RNAScript
