1. 通过将核糖体样品对解离缓冲液透析并用 7%~30% 的线性蔗糖梯度离心来将真细菌 70S 核糖体分离为 30S 和 50S 亚基。
解离缓冲液：
10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5
1 mmol/L MgOAc
100 mmol/L NH4Cl
1 mmol/L DTT
0.5 mmol/L EDTA
2. 测量样品在 A260 下的光吸收，将样品用解离缓冲液稀释至每毫升 100~150 A260。
3. 将样品于 4℃ 对解离缓和液透析 5 分钟。
4. 用解离缓冲液制备 7% 和 30% 的蔗糖溶液。用 Millipore 过滤蔗糖溶液。
5. 线性蔗糖梯度可以按前述方法在 Beckman Vti 50 转头配套的管中制备。制备 37 ml 梯度和 2 ml 样品。在梯度的制备中，应自下而上地先向管底倒入 18.5 ml 7% 蔗糖溶液，然后倒入 18.5 ml 30% 的蔗糖溶液，从而使浓度渐高的蔗糖将低密度的蔗糖托起。于 4℃ 放置 2~16 小时使梯度形成。
6. 于 42℃ 保温 5 分钟使样品热激活，然后向每个梯度中加载 150~200 A260 单位的样品。
7. 将梯度于 4℃ 以 50000 r/min ( 242000 g ) 离心 70 分钟。
8. 对梯度进行分部收集（每 30 滴为一个分部），确定 A260 曲线，分别倒出单个亚基峰的收集液，用 Beckman 50.2 Ti 转头以 30000 r/min 离心 16 小时来沉淀亚基。
9. 为确保每一亚基样品中含有的其他亚基或其他蛋白质的污染少于 0.5%，可以将亚基作两次梯度离心。
10. 将亚基沉淀物存于 -80℃ 中长期贮存。为便于使用，将沉淀重悬于少量体积的贮存缓冲液中并贮存于 -80℃。
贮存缓冲液：
20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5
10 mmol/L MgOAc
100 mmol/L NH4CI
1 mmol/L DTT
0.5 mmol/L EDTA
60% 甘油
11. 用 1.5 % 的琼脂糖凝胶电泳确定亚基的纯度。从每一份样品中取一份与等体积的 RNA 凝胶上样缓冲液混合，缓冲液为 0.5% 的 SDS，40% 蔗糖的水溶液。
(1) 哺乳动物核糖体
① 将多核糖体沉淀重悬于哺乳动物解离缓冲液中，于 4℃ 保温 15 分钟。
哺乳动物解离缓冲液：
50 mmol/L 盐酸三乙醇胺，pH 7.5
5 mmol/L MgCl2
500 mmol/L KCI
1 mmol/L 嘌呤霉素
② 保温后，加入 MgCl2 至终浓度为 50 mmol/L。将样品用 Beckman Ti 60 转头于 4℃ 以 305000 g 离心 5 小时。将沉淀重悬于不含嘌吟霉素的解离缓冲液中。
③ 用不含嘌呤霉素的解离缓冲液制备 10% 和 40% (w/w) 的蔗糖溶液。如同真细菌核糖体亚基解离方法中描述的一样，将 0.5 ml 等份铺于 12 ml 的 10%~40% 线性蔗糖梯度之上。
④ 将梯度用 Beckman SW41 转头于 4℃ 以 190000 g 离心 5 小时。后续步骤同真细菌核糖体分离方法中的一样。
(2) 叶绿体核糖体
① 将核糖体沉淀重悬于叶绿体解离缓冲液中：
叶绿体解离缓冲液：
10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5
50 mmol/L NH4CI
0.1 mmol/L MgOAc
6 mmol/L β-巯基乙醇
② 用以上缓冲液制备 7%~30% 的线性蔗糖梯度。按照真细菌核糖体亚基解离步骤中的方法制备梯度。
③ 将样品铺于梯度之上，然后用 Beckman VTi 50 转头于 4℃ 以 50000 r/min ( 242000 g）离心 70 分钟。后续步骤同真细菌核糖体分离方法中的一样。 展开 | 
