改进的QuEChERS方法结合UPLC―MS/MS
改进的QuEChERS方法结合UPLC―MS/MS同时快速检测8种蔬菜中77种农药残留
农药残留检测方法很多，包括色谱方法、免疫分析法、生物传感器法等[1]，其中的色谱技术是大多数国家规定的技术，但此类方法的样品前处理复杂。随着农药残留监测工作的深入开展，对检测技术的要求越来越高，并向着简单、快速、灵敏、多残留、低成本和易推广的方向发展。无论是发达国家还是发展中国家，都把如何准确快速地完成检测工作作为农药残留检测技术研究的热点。目前，我国农药残留检测方法主要有两大类：农药残留快速检测法和色谱法。农药残留快速检测法易出现假阳性或假阴性结果[2]。而色谱法更为精确，其中的液质联用法在色谱法中的应用范围和所起作用日益突出。在农药多残留检测分析中，因农产品的种类非常多，就蔬菜而言，常见的也有上百种，因此，检测过程中的基质影响不可避免，样品净化是分析检测过程中的关键环节，其目的就是最大限度地提取目标物，把干扰降到最低、误差降到最小，所以样品前处理直接影响结果检测的准确性。
基质影响是1993年Tang等[3]首先观察了的现象， 它是指分析物在标准溶液和生物基质中的响应值产生差异， 根据其响应值被加强还是减少描述为离子抑制或离子增强。基质效应主要由溶液中非挥发性或弱挥发性物质影响分析物带电雾滴的形成或挥发效率所致，目前基质效应产生的具体机制虽还未清楚[4]，但从客观上分析来看，其产生不仅与样品中除分析物以外的其他成分的组成及含量有关，还与分析系统的方法、试剂、进样方式等有关[5]。
QuEChERS方法是样品预处理方法，是Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged and Safe的英文简称，即快速、容易、便宜、有效、耐用和安全。2003年Anastassiades等[6]首次报道用于蔬菜和水果的预处理。其实质是将传统的液液萃取、分离和基质固相分散技术组合起来的预处理方法，我国自2005年引进QuEChERS方法。但自QuEChERS方法建立以来，大部分的分析工作者只是对方法操作步骤的引用，对于该方法各操作过程的影响因素及量化并未做进一步探讨。本试验正是基于8种蔬菜的复杂基质影响，对QuEChERS方法进行探索性改进，调整检测条件，改善前处理条件，就提取溶剂比较、吸附剂的选择、用量比例等对样品净化效果的影响因素进行了研究，提出77种农药残留在8种蔬菜中的UPLC-MS/MS色谱检测方法。
1材料与方法
1.1主要仪器设备与试剂
Acquity UPLC超高效液相色谱仪及XEVO TQ MS三重四极杆质谱仪（Waters公司）；固相吸附剂有伯仲胺（PSA）、氨基粉（NH2）、C18、石墨化炭黑（GCB）（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；聚丙烯塑料离心管（新康医疗器械有限公司）；乙腈氯化钠、醋酸钠、无水硫酸镁、甲醇和有机滤膜（北京迪马科技有限公司）；所用供试农药标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，试剂为分析纯或色谱纯，水为超纯水。
1.2供试蔬菜的确定
所选择的甘蓝、油菜、芹菜、茎用莴苣、胡萝卜、辣椒、番茄和豇豆8种蔬菜，涉及叶菜类、甘蓝类、根茎类、茄果类和豆类5大类，基本涵盖人们日常消费的蔬菜品种，也基本包括了蔬菜的不同生育特点，基质干扰差异较大，对检测方法的适用性有很大提高。8种供试蔬菜为市售蔬菜。
1.3标准溶液的配制
1.3.1标准储备液分别称取各种农药标准品适量（精确至0.01 mg），置于50 mL容量瓶中，根据标准品的溶解性选择甲醇、乙腈或丙酮-正己烷（体积比1 ∶1）溶解并定容，配制成浓度为200 μg/mL的标准储备液。
1.3.2混合标准溶液根据农药在仪器上的响应灵敏度，确定其在混合标准溶液中的浓度（表1）。依据每种农药的混合标准溶液浓度以及标准储备液的浓度，移取一定量的单个农药标准储备液于50 mL容量瓶中，用甲醇定容。混合标准溶液在4 ℃避光保存，可使用6个月。
1.4样品前处理方法
1.4.1提取准确称取粉碎后的蔬菜样品5 g（精确至 0.01 g），置于50 mL塑料离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋提取2 min，加入1 g氯化钠，涡旋1 min，4 000 r/min离心 5 min，静置待乙腈相和水相分层。 1.4.2净化取2 mL上层乙腈相溶液置于装有50 mg C18、50 mg NH2和10 mg GCB的10 mL离心管中，涡旋1 min，4 000 r/min 离心5 min，取0.5 mL上清液，加入0.5 mL甲醇-水溶液（体积比50 ∶50），混匀，过0.22 μm有机滤膜，LC-MS/MS 检测。
1.5检测条件
1.5.1色谱条件色谱柱：Acquity BEH RP18柱 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；以乙腈（A相）和0.1%甲酸水溶液（B相）为流动相进行线性梯度洗脱；梯度洗脱程序：0～20 min，A相的比例由5%线性变化至95%，20～22 min，A相的比例保持5%；流速为0.2 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。
1.5.2质谱条件电喷雾正负离子电离模式（ESI+和ESI-）；毛细管电压3.0 kV；离子源温度110 ℃，脱溶剂气温度：380 ℃，脱溶剂气速率：550 L/h，锥孔反吹气速率：50 L/h。检测方式为多反应监测扫描（MRM），按保留时间进行农药组分监测。
2结果与分析
2.1流动相的选择
本研究分别以甲醇-水、乙腈-水、甲醇- 0.1%甲酸水和乙腈- 0.1%甲酸水为流动相，按照“1.5.1”节中的梯度洗脱条件进行检测，结果表明，0.1%的甲酸水比水效果好，有利于提高待测物的离子化效率，从而提高待测物的灵敏度。此外，乙腈比甲醇洗脱效果好。以乙腈- 0.1%甲酸水为流动相，农药分离效果最好，色谱峰尖锐、对称，响应灵敏度最高。
2.2质谱条件的优化
将农药分别配制成1 μg/mL的单个标准溶液，以蠕动泵注射的方式分别将单标进质谱，在电喷雾（ESI）电离模式下分别对每种农药进行一级全扫描，确定分子离子，并优化得到分子离子响应信号最高时的锥孔电压。然后将其分子离子打碎，进行二级质谱全扫描，每种农药找到2个子离子，要求子离子的质核比（m/z）尽量大于100，且响应信号较稳定，分别优化得到子离子响应信号最高时的碰撞能量，最后以多反应监测（MRM）扫描方式进行扫描。按照残留分析确证检测的要求，每个母离子选择2个子离子用来定性，并以丰度较强的子离子用来定量。绝大多数农药在电喷雾正离子模式下（ESI+）均能产生较强的[M+H]+分子离子，少数农药在电喷雾负离子模式下（ESI-）[M-H]- 产生分子离子，如咪草烟和氟磺胺草醚等。
按照保留时间排序，编辑多反应监测扫描方法，进行分段采集。这样可以提高单位时间内离子的扫描次数，从而提高检测灵敏度。最后筛选得到的77种农药的保留时间、监测离子对、锥孔电压和碰撞能量见表1。
2.3定容溶液的选择
2.7方法的准确度与精密度
考虑到国内绝大多数农药残留限量均大于0.01 mg/kg，在豇豆中添加混合标准溶液进行回收试验，平行分析5次，计算回收率和相对标准偏差。结果表明，在3种添加水平下，77种农药的平均回收率在77.4%～100.7%之间，相对标准偏差（RSD）在6.7%～12.4%之间，符合检测方法验证的要求。考虑到前处理方法中除杂所用的混合吸附剂的各自作用，开展基质效应对所建立方法的影响分析，进行方法的适用性验证。选择了其他7种蔬菜品种甘蓝、油菜、芹菜、茎用莴苣、辣椒、番茄和胡萝卜，同样在0.01、0.05、0.1 mg/kg 3种浓度水平下进行添加回收试验。结果显示，77种农药在甘蓝中的平均回收率为77.4%～100.7%， RSD在6.7%～12.4%之间；油菜中的平均回收率为76.9%～93.1%，RSD在5.6%～137%之间；芹菜中的平均回收率为82.3%～103.4%，RSD在7.4%～10.7%之间；茎用莴苣中的平均回收率为77.2%～108.7%，RSD在7.8%～11.4%之间；辣椒中的平均回收率为78.1%～1089%，RSD在8.1%～10.7%之间；番茄中的平均回收率为71.6%～94.0%，RSD在5.8%～15.8%之间；胡萝卜中的平均回收率为81.2%～92.6%，RSD在3.2%～17.6%之间。表明针对77种农药残留所建立的检测方法同样适用于甘蓝、油菜、芹菜、茎用莴苣、辣椒、番茄和胡萝卜中农药多残留的测定。
3结论与讨论
本研究根据农药的理化性质，并结合辽宁省的农药使用情况，采用超高效液相色谱-串联质谱分析技术，通过对色谱条件和质谱条件的优化确定，利用改进后的QuEChERS方法，建立了不同种类蔬菜中77种农药多残留的分析方法。
在定容溶剂的选择试验后，确定了甲醇-0.1%甲酸水[V（甲醇） ∶V（0.1%甲酸水）=70 ∶30]的定容溶剂。
不同因素对提取净化效果的影响。本研究比较了样品量、提取溶剂、盐析除水剂种类及分散固相吸附剂种类和比例对样品净化效果的影响，确定了合适的取样量、最佳提取溶剂、除水剂和吸附剂用量。结果显示：对于新鲜果蔬样品，取样量与提取溶剂的比例为1 ∶2较为合适；因使用 LC-MS/MS 检测技术，没必要把水除尽，所以盐析除水剂只选择氯化钠，未加无水硫酸镁，且含少量水分有利于提高部分农药的回收率，也会改善农药的色谱峰形；最终确定了2 mL的提取液选择NH2+C18+GCB组合净化剂，用量比例为 50 mg ∶50 mg ∶10 mg，能得到更为满意的净化效果。
与传统的QuEChERS方法相比，盐析选择更为廉价的氯化钠，固体吸附剂选择NH2+C18+GCB组合代替PSA，净化效果更好，成本更低。
常用的固相吸附剂有伯仲胺（PSA）、氨基粉（NH2）、C18、石墨化炭黑（GCB）等。PSA是一种弱阴离子交换吸附剂，能通过形成氢键去除脂肪酸、糖及其他基质共萃取物。PSA和NH2有相同的吸附原理，由于PSA同时存在伯胺、仲胺而具有更高的去杂质能力，等量的PSA比等量的NH2能去除更多的基质共萃取物。但因PSA的结构对含羧酸基团、含氟、含氯物质有保留，因此这些目标分析物的回收率会偏低。石墨化炭黑是炭黑在惰性气体的保护下加热到2 700 ℃左右生成的一种炭材料。在高温条件下，炭黑内部和表面的大孔隙结构被破坏，表面生成光滑、无孔的石墨晶型结构[7]。有研究表明GCB能够很好地去除色素和固醇类杂质[8]。 通过所建立的检测新方法，77种农药在胡萝卜、甘蓝、油菜、芹菜、茎用莴苣、辣椒、番茄和豇豆8种蔬菜中的平均回收率在77.4%～100.7%之间，RSD在6.7%～12.4%之间，从所选蔬菜的代表性考虑，该方法在农药残留定量分析中有很好的推广前景。
从所建立的检测方法的操作过程看，该方法简便、快速、安全、成本低廉、重现性良好，具有一次处理样品可同时测定多种农药残留的特点，适合于不同种类蔬菜中多类农药残留的高通量定量检测。
