经双限制酶切割用作克隆载体的λ噬菌体DNA的制备实验
实验方法原理 置换型载体（如 λ2001、λDASH、EMBL 系列、Charon 34、Charon 35 和 Charon 40 ) 含有一系列的限制位点，它们在中央填充片段的两端以相反方向排列（Frischaufet al. 1983）。
实验材料 噬菌体 T4 DNA 连接酶限制性内切核酸酶λ 噬菌体包装混合物
试剂、试剂盒 ATP氯仿乙醇酚：氯仿乙酸钠焦糖凝胶上样缓冲液
仪器、耗材 琼脂糖凝胶
实验步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
ATP ( 10 mmol/L)
氯仿
乙醇
酚：氯仿（1:1，V/V)
乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2)
蔗糖凝胶上样缓冲液
TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)
2. 酶和缓冲液
噬菌体 T4 DNA 连接酶
限制性内切核酸酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶（0.7%)，用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
4. 核酸和寡核苷酸
λ 噬菌体（置换型载体）DNA
5. 专用设备
预置于 68℃ 的水浴
6. 载体和菌株
λ 噬菌体包装混合物
二、方法
1. 将从置换型载体中纯化的 25~50 μg λ 噬菌体 DNA 与 TE ( pH 8.0 ) 混合至终体积为 170 μl。
2. 加入 20 μl 两者中任一适宜的 10X 限制酶缓冲液。取两份未消化的 λ 噬菌体 DNA，每份含 0.2 μg，置于冰浴保存。
3. 加入 4 倍过量（100~200 单位）的两者中任一适宜限制酶，按厂家推荐的温度消化 4 h。
4. 将反应于冰浴冷却至 0℃。再取出两个 0.2 μg 的组分，将其中之一（另一份保存至步骤 10 中分析）与另一份未经消化的 DNA ( 步骤 2 ) 于 68℃ 温育 10 min，以打断噬菌体 DNA 黏性末端。加小量（10 μl ) 蔗糖凝胶上样缓冲液，立刻将样品加入至 0.7% 的琼脂糖凝胶中。
5. 用酚: 氯仿抽提两次和氯仿抽提一次以纯化 DNA。
6. 用标准的乙醇沉淀回收 DNA。
7. 将 DNA 重溶于 TE ( pH 8.0) 中，浓度为 250 μg/ml。加入适宜的 10X 限制酶缓冲液，用第二种限制酶消化，同样为 4 倍过量的酶反应 4 h。
8. 用酚: 氯仿抽提两次和氯仿抽提一次以纯化 DNA，用标准的乙醇沉淀回收 DNA。
9. 将 DNA 重溶于 TE ( pH 7.6 ) 中，浓度为 300~500 μg/ml，取一组分（0.2 μg）保存于 -20℃。
10. 为了检测消化过程的有效性，用只经第一种酶消化的 0.2 μg 载体（步骤 4 中预留的组分）和最后制成的 0.2 μg 载体（步骤 9 ) 进行预连接反应。从每个连接混合物中取等量（0.1 μg）的 DNA 进行包装，对获得的噬菌体颗粒测定其滴度。
(1) 用水将 DNA 溶液的体积调整至 17 μl。
(2) 加入 2 μl 10X 连接缓冲液，如果必要，再加入 1 μl 10 mmol/L ATP。
有些商品化连接缓冲液中含有 ATP。如果用这样的缓冲液，就不再需要另加 ATP。
(3) 取 10 μl 步骤 (2) 中制成的混合物，冰浴保存。
(4) 在剩余的混合物（步骤(2) ) 中，加入 0.2~0.5 weiss 单位的 T4 DNA 连接酶，16℃ 温育 2 h。
(5) 用一商品化的 λ 噬菌体包装反应将 0.1 μg 的连接和未连接样品以及 0.1 μg 的未消化载体 DNA 进行包装。
