药物诱导细胞凋亡时bcl-2表达变化
【原理】
逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
【试剂与器材】
1.上游引物:5'-CTGGTGGACAACATCGCTCTG-3'
2.下游引物:5'-GGTCTGCTGACCTCACTTGTG-3'
3.OligdT150.1μmol/L
4.TRIzol试剂
5.M-MLV。
6.dNTP2.5mmol/L分别取等体积的10mol/L的dATP，dGTP，dTTP，dCTP四种混合即成
7.TaqDNA聚合酶（国产或进口）：浓度为5U/μl，50μl反应液中加1U。
8.消毒三蒸水
9.6×载样buffer0.25%二甲苯青FF，0.25%溴酚蓝，30%甘油
10.50×TAE电泳Buffer12.2gTris，2.85ml冰醋酸，10ml0.25mol/LEDTA(pH8.0)，加水至50ml。
11.溴化乙锭(EB)溶液10mg/ml(避光保存)，每100ml琼脂糖凝胶加5μl贮存液，即凝胶中EB终浓度为0.5μg/ml，此试剂为强致癌物，要戴手套操作，避免污染环境。
12.DNAMarker
13.各种国产或进口移液器(10，20，100μl)
14.消毒的0.2mlPCR管，10μl，100μltips
15.离心机
16.PCR仪
17.水平电泳槽和电泳仪
18.紫外分析仪
【操作步骤】
1.总RNA的提取
将细胞以4.0×108/L密度接种于用12孔培养板中，每孔3mL，37℃、5%CO2孵箱中培养至细胞贴壁，加入长春新碱，使之终浓度分别为0、10、100μg/mL。继续培养过夜。按Trizol试剂盒说明，在预期时间加入1mLTrizol试剂，置室温5min，吸至1.5mL经DEPC水处理过的EP管中，置室温5min，加氯仿0.2mL，振摇50s，置室温5min，分层。4℃，11000×g离心15min。仔细取上层水相，移至另一EP管中，加0.5mL异丙醇，混匀。置室温10min，4℃11000×g离心10min，用DEPC处理的75%乙醇洗涤沉淀(RNA)，4℃，7200×g离心5min，弃上清真空干燥后，沉淀溶解于20μL无RNase的水中，样品保存于-20℃备用。RNA样品用紫外分光光度仪测定A260和A280，计算含量。
2.逆转录
按下列步骤进行逆转录,合成cDNA第一链?总RNA5μL(2μg),
95℃,3min;加oligo(dT)2μL,70℃,5min,冰浴5min,离心?加5×M-MLVbuffer5μL?dNTP(每一种浓度为2.5mmol/L)5μL?M-MLV(200u/μL)1μL?
40U/μLRNase1μL?DEPC处理水6μL,总体积25μL,瞬间离心,混匀,
42℃水浴60min?合成的cDNA于4℃或-20℃保存备用?
3.PCR
取0.2mlPCR管，按下表操作：
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试剂 |
加入量 |
最终浓度(或含量) |
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cDNA |
2μl |
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10×buffer |
5μl |
1×buffer |
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10×MgCl2 |
5μl |
2.5mmol/L |
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dNTP |
4μl |
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上游引物 |
5μl（5μmol/L） |
25pmol |
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下游引物 |
5μl（5μmol/L） |
25pmol |
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TaqDNA聚合酶 |
0.2μl(5U/μl) |
1U |
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消毒三蒸水 |
24μl |
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总体积 |
50μl |
用手指弹管壁混匀 ，稍离心，盖盖，编号。于PCR仪上进行PCR反应。PCRPCR反应参数为:热启动94℃，3min;94℃,30s,50℃,30s,72℃,50s,30个循环；72℃,3min。反应完成后，取10μL样品在0.8%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，成像。
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科技前沿
