浙江大学用户发表文章采用MassWorks对转化产物进行了确证
继甘肃省出入境检验检疫局技术中心周围主任等，利用MassWorks质谱校正技术在Rapid Commun. Mass Spectrom(2011, 25, 3097–3102)发表高水平外文文章后，浙江大学瞿海斌教授在Industrial & Engineering Chemistry Research(美国)上发表英文文章《Application of Multivariate Curve Resolution Method in the Quantitative Monitoring Transformation of Salvianolic Acid A Using Online UV Spectroscopy and Mass Spectroscopy》，采用MassWorks在单四极杆质谱上测定了丹酚酸A两种转化产物的精确质量数，并利用谱图准确度实现了对这两种产物分子式的准确识别。
多元曲线分辨法在在线紫外光谱和质谱定量检测丹酚酸A转化中的应用
Xintian Zheng，Xingchu Gong，Qin Li，Haibin Qu
(浙江大学药物信息研究所)
摘要：本文应用在线紫外光谱检测分析系统对丹酚酸A(SAA)的转化过程进行了探索性研究。一种基于多元曲线分辨的化学计量学方法应用于解决反应物浓度和谱图分布问题从而评价动力学分布。为研究温度和pH两个因素对SAA转化过程的影响，动力学测试将温度设定在25-90℃，pH值设定在2.5-10范围内。SAA转化过程中首先发生降解反应，当温度升高时，SAA的降解速度加快。当pH值高于7时，SAA转化速度加快，当pH值小于6.5时则可保持稳定。用MassWorks软件结合单四极质谱测定了SAA的两种转化产物的精确质量数，并借助谱图准确度实现了对这两种转化产物的确证。结果表明，在中药制剂生产过程中，作为主要生物活性物质的SAA不应在高温和高pH值条件下生产。
1 前言
丹酚酸A(SAA)是丹参的主要有效成分，具有多种药理活性，包括抗血小板、抗肝纤维素化、消炎、抗癌等特性1。SAA的这些功能据推测源于其强大的抗氧化性2-7。因此，SAA作为一种新的待开发药物在制药领域受到广泛的青睐。作为咖啡酸和丹参素的三聚体，SAA在水溶液中和丹参的某些制备过程中是不稳定的8。在整个加工过程中加热或强酸强碱都可能导致SAA的转化。无疑，SAA的稳定性将会影响SAA制备药物的功效和安全性。
至今，对中药材不稳定生物活性物质的转化或降解的研究较少9-11。而且这些研究都是应用离线检测方法。这些离线检测方法通常费时费力，当转化很慢时可适用。然而，当转化速度较快时，水解、氧化和沉淀等副反应在离线样品测定过程中可能同时发生。因此，需要一种实用、快速且无损的在线监测方法，如连续流动系统。这种在线监测具有重现性好、过程自动化、样品和试剂消耗低等优点。同时还可对降解过程进行动力学研究12。
本文采用在线紫外光谱检测方法监测了SAA的转化过程。多元曲线分辨法可用于解决吸收分布、反应物光谱提取和辅助定量等问题。结果用于动力学模型而得到速率常数。MassWorks软件结合单四极质谱分析提供了有关转化产物可能标示的确证信息。
2 材料和方法
2.1 试剂和药品：纯度大于95%的SAA及其转化产物通过HPLC分析，在本实验室得到分离纯化。色谱级乙腈和甲酸分别购自Merck(Darmstadt，德国)和Tedia(Fairfield，OH，USA)。高纯水通过Millipore Milli-Q系统(Milford，MA,USA)制备。其他化学物质均为分析纯。
2.2 仪器条件：T6紫外分光光度计(Pukinje,Beijing,China)带win5软件(Pukinje,Beijing,China)，用于光谱采集，设置如下：扫描范围220-400nm，数据间隔1nm，中等扫描速度，5mm石英流通池通路。
连续流路由K501泵(Lumtech Analytical，Germany)、一个水浴反应器，一个流通池和一个蠕动泵管(200cm*2mm ID)组成。过程中，泵以20ml/min的流速连续提供样品，样品溶液在9s内到达检测器流通池。在线紫外分光光度分析系统示意图如图1所示。
图1 在线紫外分光光度法分析系统示意图，P为二元泵，流速20ml/min.T为温度控制系统.PC为光谱采集的工作站.水浴设置不同的温度如表1所示。
安捷伦单四极杆质谱(Agilent, IL,USA)带ESI接口用于质谱检测分析。所有样品通过过滤器直接注入质谱分析而不过柱子分离。流动相为0.1%甲酸水(A)和0.1%甲酸乙腈(B)。流速为0.5ml/min。高纯氮用作干燥气。电喷雾负离子模式监测参数设置如下：毛细管温度350℃，毛细管电压3500V，干燥气流速10ml/min，雾化气电压40psi。全扫质谱分析，谱图扫描在100-800m/z范围内。扫描数据以完整模式存储用于MassWorks(Cerno Bioscience)分析。同时，离子阈值设为0，采集速率为0.05。
2.3 步骤：略。
2.4 多元曲线分辨法：略。
2.5 反应产物的确证：不同的时间间隔，应用质谱法采集和分析每份20ul的样品，来确定转化产物。为得到稳定的信号，每个样品扫描2min。得到的数据导入MassWorks软件分析。SAA作为纯标准用于内标校正。MassWorks软件提供了转化产物的计算的精确质量数和可能的分子式。
3. 结果和讨论
3.1 SAA转化中温度和pH的影响：略。
3.2 MCR-ALS分析转化实验：略。
3.3 动力学计算：略。
3.4 SAA转化过程的质谱分析：本实验的MCR结合UV分析方法没有排除反应最终产物为单组分的多种物质共存的情况。本实验提到的反应中，同样动力学分布得到的许多物质的分子式(例如，两种物质具有相同的浓度分布和谱图分布)能够产生所谓的谱图矩阵秩脱。所以，许多物质被认为是许多不同分子结构的混合物，而不是单一分子结构的纯净物。
反应系统中化学物通过质谱检测和MassWorks软件的进一步证实进行确证。MassWorks软件能够提供这些转化产物的精确质量数。采用包括质荷比和峰形的全面校正得到较高的谱图准确度，达到更准确的组分检测34。转化产物的准分子离子峰为509和491。结果列于表2和表3，说明在反应系统中产生两种转化产物C26H21O11和C26H19O10。结果与我们之前研究的SAA(C26H22O10,[M-H]- M/Z=493)90℃下在水溶液中被氧化，反应产物包括丹酚酸C(C26H20O10，[M-H]- M/Z=491)异丹酚酸C(C26H20O10, [M-H]- m/z=491)和两种新的多酚酸(C26H22O11，[M-H]- M/Z=509)35的结果相同。这些转化产物的标准质谱图如图7所示，基于MCR得到这些产物的质谱。4种氧化产物相似的紫外光谱图如图8。MCR-ALS软模式分离和鉴定的的每个物质的光谱图说明其有着本质的区别。相反，MCR结合紫外光谱方法是一种有效的方法，不需要分离，因此，其在在线化学过程监测中是一种很有用的方法。
表2 MassWorks软件分析的SAA转化产物分子离子[M-H]-m/z=491a的结果
| Row | 分子式 | 单同位素 | 质量误差（mDa） | 质量误差（PPM） | 谱图准确度 | RMSEb | DBEc |
| 1 | C26H19O10 | 491.0978 | 8.0821 | 16.3348 | 98.8484 | 111 | 17.5 |
| 2 | C27H15O6N4 | 491.0992 | 9.3592 | 19.0581 | 98.6705 | 128 | 22.5 |
| 3 | C25H19O9N2 | 491.1091 | 19.2552 | 39.2092 | 98.6675 | 129 | 17.5 |
| 4 | C28H15O7N2 | 491.0879 | -1.8742 | -3.8163 | 98.4743 | 147 | 22.5 |
| 5 | C29H15O8 | 491.0767 | -13.1075 | -26.6907 | 98.2584 | 168 | 22.5 |
| 6 | C24H15O10N2 | 491.0727 | -17.1303 | -34.8822 | 98.063 | 187 | 18.5 |
| 7 | C23H15O9N4 | 491.0839 | -5.8969 | -12.0078 | 97.8277 | 210 | 18.5 |
| 8 | C30H11O4N4 | 491.078 | -11.7701 | -23.9674 | 96.715 | 317 | 27.5 |
| 9 | C22H19O13 | 491.0826 | -7.2343 | -14.7311 | 96.3391 | 354 | 13.5 |
| 10 | C21H19O12N2 | 491.0938 | 3.9991 | 8.1433 | 96.0909 | 378 | 13.5 |
a表示主要基于谱图准确度得到的前十个可能结果的排序，bRMSE为根均方误差，cDBE为双键当量
表3 MassWorks软件分析的SAA转化产物分子离子[M-H]-m/z=509a的结果
| Row | 分子式 | 单同位素 | 质量误差（mDa） | 质量误差（PPM） | 谱图准确度 | RMSEb | DBEc |
| 1 | C26H21O11 | 509.108 | 5.5865 | 10.9733 | 99.0328 | 93 | 16.5 |
| 2 | C25H21O10N2 | 509.1196 | 16.8199 | 33.0383 | 99.0208 | 94 | 16.5 |
| 3 | C24H17O11N2 | 509.0832 | -19.5656 | -38.4315 | 98.7263 | 122 | 17.5 |
| 4 | C23H17O10N4 | 509.0945 | -8.3322 | -16.3665 | 98.506 | 144 | 17.5 |
| 5 | C27H17O7N4 | 509.1097 | 6.9239 | 13.6002 | 97.5403 | 236 | 21.5 |
| 6 | C28H17O8N2 | 509.0985 | -4.3095 | -8.4648 | 97.3443 | 255 | 21.5 |
| 7 | C29H17O9 | 509.0873 | -15.5429 | -30.5299 | 97.1286 | 276 | 21.5 |
| 8 | C22H21O14 | 509.0931 | -9.6696 | -18.9934 | 96.8266 | 305 | 12.5 |
| 9 | C21H21O13N2 | 509.1044 | 1.5638 | 3.0716 | 96.5844 | 328 | 12.5 |
| 10 | C20H21O12N4 | 509.1156 | 12.7972 | 25.1367 | 96.3349 | 352 | 12.5 |
a表示主要基于谱图准确度得到的前十个可能结果的排序，bRMSE为根均方误差，cDBE为双键当量
4. 结论
略。
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