小鼠胚胎干细胞的培养
实验概要
了解小鼠胚胎干细胞的培养方法。
主要试剂
1. 贮存液
DMEM(高糖)
胎牛血清
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巯基乙醇（55Mm）
转铁蛋白50mg/ml
胰岛素5mg/ml
亚硒酸钠300μM
黄体酮（20μM）
腐胺（100μM）
PEST（P104U/ml S104μg/ml）
层粘连蛋白（100μg/ml）
纤维连接蛋白（250μg/ml ）
碱性rhFGF, （10μg/ml）
2. 包被液的准备
多聚-L-赖氨酸，15μg/ml
把75ml多聚-L-赖氨酸和425ml 1×PBS混合。贮存在4℃。
纤维结合蛋白，1μg/ml
把0.5ml纤维结合蛋白和500ml 1×PBS混合。
3. 冻存液
90％HS和10％DMSO
4. 0.1％geltin溶液
培养基：
1. ES
配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。
2. EB
配制一20×不含DMEM，FBS，LIF的溶液（该溶液也能用于ES培养基--见前述）。分装在50ml
离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。将21ml该溶液和50ml
FBS加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。
3. ITSFn and N3（分化培养基）：
配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分装在15ml 离心管中，（稀释为1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm滤膜过滤，贮存在-20℃。将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基，贮存于4℃。
实验步骤
1. 复苏细胞
细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：
1) 从液氮中取出一管细胞；
2) 将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；
3) 将细胞转移到一15ml Falcon管中；
4) 加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
5) 离心3分钟；
6) 弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
7) 接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；
8) 孵育。
2. 冻存细胞
步骤：
1) 1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；
2) 用细胞刮刀收集细胞；
3) 将细胞转入15ml 离心管管内并离心3分钟；
4) 弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10 cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）
5) 分装于冻存管内，每管1ml；
6) 置－80℃过夜，第二天移入液氮。
3. Geltin（明胶）包被
准备500ml 0.1％geltin溶液
1) 将0.5 g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。
2) 最好在溶液没有冷却的情况下通过0.22 μm滤膜过滤，贮存在4℃。
4. 包被培养板或培养皿
1) 加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15 cm培养皿加2ml，10 cm培养皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；
2) 置室温30分钟；
3) 去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平放或倒扣，以免明胶污染盖子和流出培养板。
4. 细胞传代
建议每2天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。
1) 去除培养液；
2) 无钙镁PBS（Gibco）洗涤；
3) 加入胰酶EDTA（Gibco）。37℃孵育5分钟。
4) 加入ES培养基使胰酶失活；
5) 将细胞转入15 ml离心管中离心3min；
6) 去除上清，将细胞重悬于2 ml ES培养基，至少吹打10－20次。
如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。
7) 将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；
8) 将含有细胞的培养基转入geltin包被的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向）
9) 建议按1：4－1：10的比率传代 (ATCC)
保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。
5. 包被过程
1) 加入多聚-L-赖氨酸，至少2－3小时（过夜也行）
2) 吸出多聚-L-赖氨酸
3) 加入纤维结合蛋白，大约1－2小时
4) 吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干
5) 贮存在4℃
24孔板用200μl，6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。
6. 体外分化方法
1) ES培养基
在LIF存在的条件下维持细胞培养
2) EB培养基
使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
A．分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）
B．纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。
C．用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液
D．一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
E．2天后更换培养基
将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
F．用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。
3) ITSFn培养基
在最少量培养基中选择神经前体细胞
A．在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基
B．并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
C．保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
4) N3培养基＋bFGF
通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。
A. PBS洗涤，加入1-2ml 胰酶
B．37℃孵育5分钟
C．用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。
D．将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。
E．将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。24孔板接种3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。
F．2天后更换培养基
5) N3培养基
通过撤除bFGF使神经前体细胞分化
A．细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基
B．根据需要换液（大约每隔一天）
C．分化10～15天后固定细胞
6) 移除培养基
PBS洗涤，加入4%福尔马林，室温放置30分钟，PBS洗涤2次，储存于PBS。长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS
7) 移植细胞的准备
细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板）。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。
移植：
A．将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下来。
细胞被离心3分钟会更好。放置使之沉降将会去除更多的单个细胞（包括死细胞）而这些细胞可以被离心下来。
B．去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中
C．离心3分钟
D．去除上清加入1×胰酶（10cm的培养皿加1ml）
E．37℃水浴5分钟
F．加入5mlEB培养基小心吹打约10次
小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。
G．离心2分钟
H．吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基
I．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次
J．离心2次
K．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基
8) 烟酸己可碱标记ES细胞进行移植
A．准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液（双苯酰亚胺，在冷冻室118）
B．加入1mg（你能称到的最小量）到5ml EB培养基（制成200μg/ml）
C．将溶液稀释成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培养基）
D．如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液，
E．将悬液置于室温（或冰上）30分钟
F．离心2分钟
G．吸出上清将细胞重悬于2ml EB培养基
H．重复一次
I．离心2分钟
J．吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基并置于冰上。
