琼脂糖凝胶电泳分离 乳酸脱氢酶同工酶实验
电泳分离法
实验方法原理 |
乳酸脱氢酶( lactate dehydrogenase, 简称为LDH) EC ( 1 ,1 , 1 . 2) 存在于一切有糖酵解作用的细胞中, 在NAD+存在下催化乳酸脱氢形成丙酮酸或使丙酮酸还原成乳酸。其酶蛋白是由四个亚基组成的四聚体, 亚基有心脏型( H 型) 及肌肉型( M型) 两种。根据酶蛋白四聚体中H 型和M 型亚基比例的差别,可将LDH 同工酶分为五种, 即LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。亚基分子量相似, 为35000左右, 但带电荷情况不同,因此在电泳时有不同的电泳速度。本实验系用琼脂糖凝胶作支持介质, 在pH8 . 6 的巴比妥缓冲液中电泳, 将LDH 同工酶分离。以乳酸为底物, 在氧化型辅酶I 存在时, LDH 可使乳酸脱氢生成丙酮酸, 使NAD+ 还原成NADH2 , NADH2 又将氢传递给吩嗪二甲酯硫酸盐( PMS ) ,PMS 再将氢传给氯化硝基四唑蓝(NBT ) , 使其还原为蓝紫色化合物。因此, 有LDH 活性的区带即着蓝紫色。 |
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实验材料 | 乳酸脱氢酶 |
试剂、试剂盒 | 琼脂糖 巴比妥缓冲液 蒸馏水 乳酸钠溶液 氯化硝基四唑蓝水溶液 氧化型辅酶Ⅰ 吩嗪二甲酯硫酸盐 醋酸溶液 尿素水溶液 |
仪器、耗材 | 电泳槽 电泳仪 恒温培养箱 冰箱 |
实验步骤 |
1 . 凝胶板的制作: 将电泳洗净、干燥, 两边用胶带封口,选好梳子并装好, 调节水平, 浇已熔化好的0 . 7%琼脂糖凝胶适量, 冷至凝固, 然后移至4 ℃冰箱中放置30~50 min 后使用。
展开 |
注意事项 |
1. 在LDH 同工酶显色后, 往往在LDH1 前沿有一块桃红色的非特异性显色区域, 这不是LDH1 的组成部分, 定量时应去掉。 2. 溶血标本对结果有明显影响, 不能采用。 3. 本法也适用于各种体液LDH 同工酶测定。
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