聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）分离血清蛋白质(二)
在盘状电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应,使样品分离效果好，分辨率高。例如人血清用纸电泳（PH8.6）可以分成5～7个成分，而用盘状电泳也可分成20～30个条带清晰的成分（参看图15-3）。若采用不连续的浓度梯度凝胶柱，则可增至62个条带。又如人的唾液经盘状电泳。可分出10多个蛋白质条带（参看图15-4）。
下面就盘状电泳过程中三种物理效应的原理加以说明。
1．样品的浓缩效应：由于电泳基质的四个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。
（1）凝胶层的不连续性：三层不同的凝胶，其作用如下：
样品胶：为大孔凝胶，用光聚合法制备，样品预先加在其中再聚合起防止对流的作用，避免样品跑到上面的缓冲液中。
浓缩胶：为大孔凝胶，用光聚合法制备，有防对流作用。样品在其中浓缩，并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。
分离胶：为小孔胶，一般采用化学聚合法制备。样品在其中进行电泳和分子筛分离。也有防对流作用。
蛋白质分子在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。进入小孔凝胶时遇到的阻力大，速度就减慢了。由于凝胶层的不连续性，在大孔与小孔凝胶的界面处就会使样品浓缩，区带变窄。
（2）缓冲液离子成分的不连续性
在电场中如有两种电荷符号相同的离子向同一方面泳动，其迁移率不同，两种离子若能形成界面，则走在前面的离子称为快离子（又称先行离子），走在后面的离子称为慢离子（又称随后离子）。为使样品达到浓缩的目的，需在电泳缓冲系统中加入有效迁移率大小不相同的两种离子。并使这两种离子在缓冲系统中组成不连续的两相。即在三层凝胶中加入快离子，在电极缓冲液中加入慢离子。
为了保持溶液的电中性及一定的pH，需加入一种与快、慢离子符号相反的离子，称为缓冲配对离子。使缓冲配对离子分布于全部电泳缓冲系统中（即三层凝胶及电极缓冲液中）。例如分离蛋白质样品时，通常用Cl-为快离子，NH2CH2COO-为慢离子，采用三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）作为缓冲配对离子。
电泳开始前，如图15-5A所示，慢离子位于两个电极槽中，快离子分布在三层凝胶中，样品在样品凝胶中，缓冲配对离子位于全部系统中。电泳进行中如图15-5B所示，快离子与慢离子的界面向下移动，由于选择适当的pH缓冲液，使蛋白质样品的有效迁移率（有效迁移率=mα，m为迁移率，α为解离度）介于快离子与慢离子的界面处，而浓缩成为极窄的区带。它们的有效迁移率按下列次序排列：mclαcl＞mpαp＞mGαG（Cl代表氯离子，P代表蛋白质，G代表甘氨酸负离子）。样品若是有颜色的，可以看到样品在界面处浓缩成极窄的区带。样品的分离，如图15-5C所示。当样品达到浓缩胶与分离胶界面处，离子界面继续前进，蛋白质被留在后面，然后分成多个区带。
