基因操作的工具酶-2
（三） DNA连接酶的反应条件
影响连接效率的因素有：
1. 温度（通常在4-15℃ ）
2. ATP的浓度(10μM／L - 1mM／L )
3. 连接酶浓度（一般平末端大约需1～2U，黏性末端仅需0.1U）
4. 反应时间（通常连接过夜）
5. 插入片段和载体片段的摩尔比（ 1∶1～5∶1）
（四）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案
1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1～5∶1），补足ddH2O 至8μl。
3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。
4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃）连接8-14hr。
三、DNA聚合酶及其应用
（一）大肠杆菌DNA聚合酶I
是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力：
5′→ 3′聚合酶活性（模板， 带3′－OH游离基团的引物、4dNTPs、 Mg2+ ）。
双链特异性的5'→3'核酸外切酶活性。
3'→5'核酸外切酶活性。
从游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。主要是校正作用。
大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途
1.利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针
利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。
2.用于DNA连接前的大缺口填充
利用5′--3′的聚合酶活性。
3.用于DNA的序列分析
利用5′--3′的聚合酶活性。
（二）Klenow片段酶
Klenow片段是大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD 。
酶催活性：⑴5’ →3’ 的聚合酶活性
⑵3’ →5’ 的核酸外切酶活性
Klenow片段的主要用途（利用5’ →3’ 的聚合酶活性）：
⑴修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端
⑵标记DNA片段的末端
底物用［α－32P］－dNTPs
⑶cDNA克隆中第二链cDNA的合成
⑷DNA序列的测定
