DNA重组（DNA recombination）技术：工具酶
一、限制性内切酶
限制性内切酶（restriction endonucleases，RE）是其中最重要的工具酶之一。它是一类核酸水解酶，能识别和切割双链DNA分子中的特定核苷酸序列。
（一）命名原则
限制性内切酶大多从细菌中发现，根据来源进行命名，限制酶的第一个字母（大写，斜体）为宿主菌的属名，第二、第三个字母（小写，斜体）代表宿主菌的种名缩写，第四个字母（斜体）是株或型，最后的罗马数字表示同株内发现和分离的先后顺序。如从流感嗜血杆菌中分离到的几种限制性内切酶分别命名为HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ等等。
（二）分类
根据酶的结构、作用的不同，可将限制性内切酶分为三种类型。Ⅱ型限制性内切酶具有高度特异性的DNA裂解点,而Ⅰ型和Ⅲ型兼有修饰（甲基化）作用和依赖于ATP的活性，但不能在识别序列上直接裂解DNA，故用途较少。因此，Ⅱ型限制性内切酶是基因工程和基因诊断中重要的工具酶，通常不特别说明的即为Ⅱ型限制性内切酶。
（三）限制性内切酶的功能
限制性内切酶识别位点以双链DNA分子的4～8个特异性核苷酸顺序为多见，其中6个核苷酸顺序最常见。酶解后5′末端为磷酸基，3′末端为羟基。限制性内切酶的识别序列一般具双重对称性，切口共有三种类型：①5′末端突出型；②3′末端突出型；③平末端型。例如EcoRI识别序列为GAATTC，酶水解发生在GA之间，产生错开的5′突出末端；PstI的识别序列为CTGCAG，水解发生在AG之间，产生错开的3′突出末端；而HpaI识别序列为GTTAAC，水解发生在TA之间，产生不错开的平末端（blunt
end）。错开突出的单链末端，很容易与互补的单链末端配对“粘合”起来，因此称为粘末端（cohesive end）
限制性内切酶切口类型
来源不同但能识别和切割同一位点的酶称为同工异源酶（isoschizomer）。如BamHI和BstⅠ(G↓GATCC),Xho和PaeR7(C↓TCGAG)，这些同工异源酶可以互相代用。
另有些限制性内切酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶（isocaudarner）。例如BamHI(G↓GATCC)和Sau3AI(N↓GATCN)，由此产生的DNA片段可通过粘末端相互连接，使DNA重组有更大的灵活性。
（四）反应条件
限制性内切酶种类很多，来源不同，但反应条件都很相似。
表7-2 限制性内切酶的一般反应条件
（五）DNA的甲基化作用
许多细菌有限制与修饰系统，该系统使外来的DNA降解，而对于自身的DNA则加以修饰不被降解。Ⅱ型限制性内切酶不具甲基化作用，这一功能由相应的修饰酶承担，它们识别同一DNA顺序而发挥作用不同，例如PstI限制酶和PstI甲基化酶均识别5′－CTGCAG－3′，前者切割5′－CTGCA↓G－3′，后者使A甲基化，形成5′－CTGCmAG－3′，甲基化后则被保护而不为PstI限制酶切割。
大多数E.coli中含有两种可使DNA甲基化的酶：dam甲基化酶和dcm甲基化酶。dam甲基化酶识别5′－GATC－3′，使A的N6位甲基化形成5′－Gm6ATC－3′，如限制性内切酶Bcl识别顺序为5′－TGATCA－3′，BclI
dam甲基化酶作用后的TGm6ATCA就不能被Bcl I
切割了。dcm甲基化酶识别5′－CCWGG－3′（W为T或A），并使一个C→m5C，甲基化后形成Cm5CWGG，就不能被识别顺序为5′CCWGG3′的限制性内切酶EcoRⅡ切割了。
（六）应用及注意事项
在分子生物学领域，限制性内切酶占有举足轻重的地位。其主要用途如下：①改造和组建质粒；②组建基因组DNA物理图谱；③基因组DNA同源性研究；④DNA重组克隆及亚克隆；⑤DNA杂交与序列分析。
限制性内切酶活性单位规定如下：在适当的温度、pH和离子强度等条件下，1小时内完全分解1μg特异DNA底物所需的限制性内切酶量，定义为1个活性单位。酶的质量是至关重要的，好的限制性内切酶应不存在任何核酸内切酶和外切酶的污染，长时间酶解不出现识别顺序特异性的下降。
限制性内切酶在非标准反应条件下，能切割一些与其特异识别顺序类似的序列，酶的特异性降低，这种现象称为星号活力，一般在限制性内切酶的右上角加一个*表示。如EcoRI*代表EcoRI的星号活力，当在高pH或低盐离子强度条件下，EcoRI的识别顺序由5′－G↓AATTC－3′变为5′－N↓AATTN－3′；另一种情况是对AATT中的A、T分辨不严格，故实验时应防止星号活力产生。诱发星号活力出现的原因有：①反应体系中甘油含量高（>5%，V/V），应使用最小酶量避免；②限制性内切酶用量过大（大于100U/μgDNA）；③低离子强度（小于25mmol/L）；④高pH环境，如pH8.0，一般建议用pH7.0的缓冲液；⑤含有机溶剂（如二甲基亚砜、乙醇、二甲基乙酰胺等）；⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二阶阳离子存在。常易发生星号活力的酶有：EcoRI、HindⅢ、PstI、SalI以及HinfI等。
二、DNA聚合酶
（一）DNA聚合酶I
DNA聚合酶I（DNA polymerase
I）是从大肠杆菌中发现的第一个DNA聚合酶，分子量为109KD。它能以DNA为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，在Mg2+的参与下，从游离3′端羟基，以5′→3′核酸聚合酶活性使DNA链延伸。此外由于它具有5′→3′核酸外切酶活性，常用于标记DNA探针（切口平移法）。
用枯草杆菌蛋白酶可将DNA聚合酶I裂解为大小两个片段，大片段分子量为76KD，这个片段也称为Klenow片段（Klenow
fragment）。它具有5′→3′聚合酶活性及3′→5′外切酶活性，而失去了5′→3′外切酶活性。Klenow片段的3′→5′外切酶活性能保证DNA复制的准确性，把DNA合成过程中错配的核苷酸去除，再把正确的核苷酸接上去。Klenow片段主要用途有：①补齐双链DNA的3′末端，使3′末端标记；②在cDNA克隆中，第二股链的合成；③DNA序列分析。
(二)Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，最佳反应温度为75～80℃。可用于通过聚合酶链式反应（PCR）对DNA分子的特定序列进行体外合成扩增，也可用于DNA测序。
（三）逆转录酶
逆转录酶（reverse
transcriptase）是多功能酶，它能催化以RNA为模板的DNA聚合反应；具有3′→5′RNA外切酶活性（又称RNA酶H活性），能特异降解RNA-DNA杂交分子中的RNA部分；它还具有DNA指导的DNA聚合酶（DDDP）功能。逆转录酶以mRNA为模板，催化合成出互补的DNA称为cDNA（complementary
DNA）。由此可构建cDNA
文库，筛选特异的结构基因。逆转录酶没有3′→5′DNA外切酶活性，因此无校对功能，错配率较高，约每2万个核苷酸链会出现一个错误。
（四）末端转移酶
在二价阳离子存在下，末端转移酶（terminal transferase，TdT）催化dNTP加到DNA分子的3′－OH,以带3′突出的DNA为最佳受体。此酶常用于给载体或cDNA加上互补的多聚体尾，造成便于重组的人工粘性末端；其次也可用于DNA片段3′末端标记。
三、DNA连接酶
DNA连接酶（DNA
ligase）催化双链DNA一端的3′-OH与另一双链DNA5′端的磷酸根形成3′，5′－磷酸二酯键，使具有相同粘末端或平端的DNA末端连接起来。连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶，重组DNA技术中常用前者。T4DNA连接酶分子量为68KD，催化两个独立DNA片段5′磷酸基与3′羟基之间形成磷酸二酯键，从而把两个独立DNA分子连接起来。必须注意的是DNA分子磷酸二酯键的断裂称为切口（nick），可以用T4DNA连接酶来修复；如DNA分子中核苷酸缺失，称缺口（gap），不能单独用连接酶来修复。
四、T4多核苷酸激酶
T4多核苷酸激酶（T4 polynucleotide
kinase）来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，催化ATP分子的γ-磷酸转移到DNA链的5′末端上。反应有二种类型：前向反应（forward
reaction）和交换反应（exchange
reaction）。在前向反应中，ATP的γ-磷酸转移到脱磷酸的DNA链的5′末端上；在交换反应中，过量的ADP使T4多核苷酸激酶将DNA链5′末端磷酸转移到ADP上生成ATP，然后再由[γ-32P]dATP上将同位素标记的γ-磷酸转移到DNA链5′末端，使之重新磷酸化。
T4多核苷酸激酶还有3′磷酸酶活性。
T4多核苷酸激酶多用于放射性标记DNA链5′末端，以进行DNA测序实验。此外也可用于连接反应，使缺少5′末端磷酸的DNA分子5′磷酸化，以便3′，5′磷酸二酯键的形成。
五、碱性磷酸酶
碱性磷酸酶有两种：由大肠杆菌分离出来的细菌碱性磷酸酶（bacterial alkaline
phosphatase，BAP）和由牛肠道分离出来的小牛肠碱性磷酸酶(calf intestinal alkaline
phosphatase，CIP)，它们都催化切除DNA、RNA和 dNTP上的5′磷酸基团。
碱性磷酸酶用于从DNA片段上除去5′磷酸，以防止自身连接；此外可用于T4多核苷酸激酶和32P标记5′末端之前，从DNA或RNA分子5′端除去磷酸，以便进一步用P32标记的γ-磷酸重新磷酸化，使5′末端被32P标记。
