溶血空斑试验
实验概要
本实验介绍了溶血空斑试验即小室液相法(Test of Plague Forming Cell)的基本原理及操作步骤。
实验原理
溶血空斑试验，又称空斑形成细胞（Plague Forming Cell，PFC）试验，是一种体外检测抗体形成细胞的方法。将一定量洗涤过的绵羊红细胞注射入小鼠腹腔，四天后将小鼠杀死，取脾脏制成脾细胞悬液，内含抗体形成细胞。然后将脾细胞、绵羊红细胞，补体混合孵育。由于PFC 所分泌的抗体和绵羊红血球结合形成抗原抗体复合物，在补体作用下可使红细胞溶解，于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑。一个空斑即代表一个抗体形成细胞。
主要试剂
1. 5％和10％绵羊红血球（SRBC）
2. 补体(经SRBC 吸收，临用时稀释成合适浓度)
主要设备
1. 解剖器械
2. 试管
3. 1ml 吸量管
4. 载玻片
5. 石蜡盘
6. 酒精灯
7. 微量加样器
实验材料
ICR 小鼠
实验步骤
1. 小鼠免疫及脾细胞悬液的制备
将5％SRBC 0.4ml注射于小鼠腹腔，4 天后拉脱颈椎处死，取出脾脏放在已加入6ml Hank's液的平皿中。在100 目不锈钢网上研磨，过滤混匀，从中吸取lml加入试管中，加满Hank's液混匀，离心1000rpm，10 分钟。将沉淀的脾细胞恢复lml容积，即为约1×107／ml浓度的细胞悬液。
2．制作小室
取无脂载玻片（75mm×25mm），平置桌面上。用双面胶带在载玻片两端和中间各粘一条，然后再覆盖上同样的载玻片，即形成两个小室。将此双层玻片的一侧长边浸入融化的石腊池中以封闭小室的一边（无需浸入过深，以能封闭小室边缘为准）。
3. 小室灌注细胞悬液
取1×107／ml脾细胞悬液100μl
10％SRBC 200μl
新配补体 200μl
Hank's 液 1ml
混匀后，用尖吸管灌注小室、蜡封、标记、平放于玻片盘内，置37℃孵箱30—45 分钟。
4. 实验结果
观察小室内的透明空斑，一个空斑即代表一个空斑形成细胞（PFC），即B细胞。
注意事项
1. 小室注入液体时不要留有气泡。
2. 小室边缘需用石蜡封严。
3. 37℃孵箱孵育时，必须放平，不可倾斜。
4. 观察结果时，应注意辨别空斑与气泡的区别，避免将气泡误认为溶血空斑。
