实时荧光定量 PCR技术用于检测插入的外源基因拷贝数
自 1994 年，第一例转基因植物产品 Flavr Savr TM 西红柿在美国上市，到 2003 年底，世界范围内转基因作物已遍布 18 个国家和地区，种植面积达 167.2 万英亩 (6770 万公顷 )( Ewen SWB,1999; 北国网 ) 。大量实践使得植物转基因技术已有了比较经典和成熟的技术路线。除了在商业领域内获得抗性植株外，植物转基因技术还延伸到植物生理学研究（生化反应途径、植物抗病、抗逆性）以及生物反应器研究（药物、疫苗等）中（ Khachatourians 2002 ）。
一般经过上游表达载体的设计构建以及下游转化体系的建立、转化品系的筛选鉴定等一系列步骤后，即获得 T 0 代转基因植物。在转化过程中，外源 DNA 随机插入植物基因组内，插入的拷贝数和位点都不固定。插入外源基因的拷贝数低（ 1 或 2 个）能较好的表达，插入的拷贝数多则会导致表达的不稳定甚至基因沉默现象（ Flavell 1994 ， Vaucheret et al 1998 ）。因此，检测 T 0 代转基因植物的外源基因的拷贝数是研究其分子特性的基础步骤之一。
Southern blot 是一种常用的 DNA 定量的分子生物学方法。其原理是将待测的 DNA 样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相 DNA 的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数。 Southern 法准确性高、特异性强，但存在费时费力的缺点。另外，由于 Southern 法检测不经过靶片段的扩增（ PCR ），一般每个电泳通道需要 10-30 μ g 的 DNA ，在实际操作中就需要较大量的植物材料来提取 DNA ，而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱，不宜大量取样。如果外源基因在插入时发生基因重组，造成限制性酶切位点丢失， Southern 法也无法检测到。这些因素都制约了 Southern 法在 T 0 代转基因植物中检测外源基因拷贝数的应用。
实时荧光定量 PCR 技术是一种较新的 DNA 定量方法。其定量的基本原理是在 PCR 反应体系中加入非特异性的荧光染料（如： SYBR GREEN I ）或特异性的荧光探针（如： Taqman 探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数： CT 值（ Cycle Threshold ）；通过将已知浓度标准品的 CT 值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。荧光定量 PCR 技术具有简便、快捷的优点，能够有效扩增低拷贝的靶片段 DNA ，对每克样品中 20pg-10ng 的转基因成分进行有效检测。同时，与 Southern 法相比，荧光定量 PCR 技术可对 T-DNA 的不同序列进行扩增，因此能实现对转基因品系中的基因重组的检测（ Giovanna 2002 ）。
选择一种合适的阳性标准品来绘制标准曲线，是应用实时荧光定量 PCR 技术准确定量模板初始浓度的基础。近年来，国内外的科学家做了不同的尝试。
P Song （ 2002 ）等人认为：理想的标准品应该是已插入外源基因的植物基因组 DNA ，并且用 Southern blot 准确测得插入的外源基因拷贝数。但是在实际研究中，很难得到这样一套标准品。因此，他提出替代方案，根据外源基因拷贝数和野生型植物基因组 DNA 的大小，按一定浓度比率混合，制成标准曲线。例如，在转基因玉米的外源基因拷贝数研究中他们发现：在加入荧光染料 SYBR GREEN I 的 20 μ L PCR 反应体系中，应以 6 ng 野生型玉米基因组 DNA 作为模板量。已知玉米基因组 DNA 大小为 2.5 × 10 9 bp （ Armuganathan and Earle 1999 ），相应于 6 ng 的玉米基因组 DNA ，即可计算出模拟 1 ， 2 ， 4 ， 8 ， 16 个外源基因拷贝时，应加入的质粒 DNA 的量。以这些梯度混合液作为标准品，就可绘制标准曲线，检测样品的浓度并计算插入的拷贝数了。实验表明，用这种方法获得的数据和 Southern blot 的结果相当一致。
Giovanna （ 2002 ）将农杆菌介导的转基因番茄作为研究材料，选择了双元载体 T-DNA 区上的两个外源基因： TSWV-N （ Tomato spotted wilt virus ）、 npt Ⅱ ( neomycin phosphoril-transferaseⅡ ) 和一个单拷贝的内源基因（ endogenous gene ）作为荧光定量 PCR 扩增的模板，检测外源基因拷贝数。他认为使用植物基因组 DNA 和一定比例质粒的混合液作为标准品，会累积许多无法避免的误差。比如使用这种标准品必需预先知道待测植物基因组 DNA 的精确分子量，并对植物基因组 DNA 和质粒准确定量，但在大多数情况下得到的数据都只是近似值，再以此混合液作为标准品检测每一转基因植株的外源基因拷贝数时，就会放大这些误差。
因此，他提出"相对 CT "或" δ-δCT "的方法，这个方法的优点是不需要为每次实验制作标准曲线，只需要一个优化步骤证明外源基因与内源基因有相同的，至少是相似的反应效率即可。使用实时荧光定量 PCR 技术先测得同一模板的目标基因和内源基因的相对比值：
R line = SQ trans /SQ end
其中 SQ trans 为样品中外源基因（ TSWV-N 和 npt Ⅱ ）的浓度； SQ end 为样品中内源基因（ endogenous gene ）的浓度。
C trans = （ SQ trans × V ） /M trans
C end = （ SQ end × V ） /M end
C trans ： C end = （ SQ trans /SQ end ）×（ M end / M trans ）
其中， C trans ， C end 分别为外源基因和内源基因的拷贝数； M trans 和 M end 分别为外源基因和内源基因的分子量。因为内源基因为单拷贝， SQ trans /SQ end 的比值就与外源基因的拷贝数成正比。
δR line = R line [(δ SQ trans /SQ trans ) 2 + (δ SQ end / SQ end ) 2 ] 1/2
应用以上公式可计算出 R line 的标准偏差 δR line 。
最后，还需要知道单拷贝外源基因 R line 值，与每一个体的 R line 值做比较，计算出其准确拷贝数。即使用已知是单拷贝的转基因植株，计算出其 R lin e 作为校正参数 R cal （ calibrator ），然后将 R cal / R line 的比值作为该品系的拷贝数。可是这种方法会将 R cal 值计算过程中的得到的初始浓度的误差不可避免的带到以后每一个品系的计算中去，造成结果的集体偏差。为此，使用下面的公式计算出 R 1 值，即单拷贝外源基因的 R line 值来替代原先的 R cal ：
F(R 1 ) = ∑ lines [R line /R 1 -N(R line /R 1 )] 2 / (δR line ) 2
其中， N(R line /R 1 ) 是最接近 R line /R 1 的整数。经计算， npt Ⅱ 基因的 R 1 值为 0.31 ； TSWV-N 基因的 R 1 值为 0.21 。将 R 1 /R line 代入公式即可知两个基因在该植株中的拷贝数。由于 npt Ⅱ 基因与 TSWV-N 基因都位于双元质粒的 T-DNA 区，若是同一植株的两个基因拷贝数不同，很可能就是在质粒整合的过程中发生了重组。 与 Southern blot 法相比，这种方法更为灵敏。
与其他检测方法相比， Giovanna 在实验中需要优化的条件少、误差小，可以得到有效、可靠的数据。另外，通过同时检测 T-DNA 上的两个外源基因： TSWV-N 和 npt Ⅱ 的拷贝数，还可以有效评估外源基因的重组情况。
参考文献
Ewen SWB, Pusztai A. Effect of diets containing genetically modified potatoes expressing Galanthus Nivalis lectin in rat small intestine. (1999) The Lancet 354, 1353-1354.
北国网 http://economy.lnd.com.cn/economy/ZX/200401/1518220040115.htm
Khachatourians GG, McHughen A, Scorza R . Transgenic plants and crops. ( 2002) New York (USA), Marcel Dekker .
Flavell RB : Inactivation of gene expression in plants as a consequence
of specific sequence duplication . (1994) Proc Natl Acad Sci USA , 91 ,
3490 
3496 .
Vaucheret H, Béclin C, Elmayan T, Feuerbach F, Godon C, Morel JB,
Mourrain P, Palauqui JC, Vernhetters S : Transgene-induced gene
silencing in plants ( 1998) Plant J , 16 , 651 
659 .
Giovanna Mason, Paolo Provero, Anna Maria Vaira, Gian Paolo Accotto. Estimating the number of integrations in transformed plants by quantitative real-time PCR. (2002) BMC Biotechnol 2 (1), 20
P Song, C Q Ca, M. Skokut, B D Kosegi, J F Petolino. Quantitative real-time PCR as a screening tool for estimatingtransgene copy number in WHISKERS?-derived transgenic maize. (2002) Plant Cell Rep 20, 948–954
