一种新兴的癌症细胞疗法—过继性免疫治疗
过继性免疫治疗（Adoptive Cell Transfer Therapy, ACT），是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。过继性免疫细胞治疗主要包括TIL、LAK、CIK、DC、NK、TCR-T、CAR-T等几大类。本篇文章作者重点介绍TIL、TCR-T以及CAR-T三种过继性免疫疗法，以及临床试验中的经验教训，为设计下一代免疫细胞疗法提供有效指导原则（图1）。
过继性免疫治疗
1、TIL-肿瘤浸润淋巴细胞
TIL疗法是从肿瘤附近组织中分离出TIL细胞，加入生长因子IL-2进行体外大量扩增，再回输到患者体内，从而扩大免疫应答，治疗原发或继发肿瘤肿瘤的方法。目前TIL疗法主要致力于提高T细胞的质量和表征，以及能简化获得肿瘤特异性T细胞的方法（图2）。例如，研究提出PD-1和4-1BB能作为肿瘤标记物对外周血细胞库进行筛选，获得肿瘤特异性T细胞，分析输注肿瘤特异性T细胞是否比传统输注TIL细胞更有效，这为T细胞个性化治疗提供了一种非侵入性的策略。还有研究提出在接种疫苗或免疫检查点抑制剂后，能潜在地分离出肿瘤特异性T细胞。
2、TCR-T疗法
TCR-T疗法是将患者体内的普通T细胞分离出来，利用基因工程技术引入新的基因，是转基因T细胞表达能够识别癌细胞的TCR-T，回输到患者体内从而杀死肿瘤细胞的治疗方法。
在早期方法中，T细胞修饰后具有表达靶向共同抗原的能力，但抗原在正常组织中也表达，治疗过程会产生严重毒性。目前TCR-T细胞的治疗已从肿瘤相关抗原转移到肿瘤特异性抗原，在诱导强抗肿瘤作用时不会对正常细胞产生毒性。最新技术-肿瘤外显子组测序和表位预测算法，能快速鉴定肿瘤细胞中因基因突变而产生的免疫原性新表位，也极大促进了TCR-T疗法的发展。
TCR-T和TIL疗法中T细胞的激活依赖于外部共刺激和通过MHC-I复合物呈递靶向新表位，而MHC-I类复合物在癌细胞中通常被下调，所以可以通过CAR修饰T细胞，CAR-T无需MHC-I类复合物的呈递，扩大了T细胞的激活信号。
3、CAR-T 嵌合抗原受体
嵌合抗原受体（CAR）是CAR-T的核心部件，通常由scFV细胞外结构域和提供TCR激活信号的西胞内信号传导结构域组成。由于CAR-T细胞的抗原识别基于scFV结合肿瘤表面抗原，因此赋予T细胞非依赖式识别肿瘤抗原的能力。
细胞外糖蛋白CD19是CAR-T治疗最常见的B细胞靶点，然而这几年临床试验结果显示使用CD19-CAR-T细胞有极高的复发率，研究人员针对此结果总结了一些重要的经验：
（1）促进T细胞有效的增值反应是临床疗效的最佳预测标准；
（2）CD19-CAR-T细胞在不同B细胞肿瘤中的治疗效果差异较大；
（3）CAR-T细胞功能障碍和CD19白血病细胞丢失是导致患者复发的主要原因；
（4）CAR-T治疗可引起显着的毒性，如细胞因子释放综合征和神经毒性等；
（5）在大多数患者中使用抗IL-6R抗体和类固醇可成功控制这些不良反应。
临床数据显示抗BCMA CAR-T细胞疗法在血液癌症中取得出色的临床反应，目前研究人员希望应用CAR-T细胞疗法治疗实体瘤。在最近的一份研究报告中，针对IL-13Rα2的CAR-T细胞治疗中，一名患者的转移性胶质母细胞瘤完全消退，研究人员针对实体瘤的初步临床实验提出了一些有利于推动CAR-T疗法的建议：
（1）尽管CAR-T细胞运输到肿瘤细胞附近，但很少观察到显着的抗肿瘤反应；
（2）抗肿瘤效力与肿瘤中CAR-T细胞是否显着扩增、持续存活有很大的关系；
（3）CAR-T细胞给药后靶向抗原表达显着降低或丧失，导致T细胞活性降低；
（4）在一些试验中观察到严重的靶向肿瘤外毒性，因此设计新型CAR-T细胞应增强肿瘤特异性抗原的靶向性以减轻毒性。
T细胞免疫治疗当前障碍
1、T细胞扩增与持久性
过继性转移T细胞的显著扩增和持久性是好的临床效果的关键因素。一些TIL和TCR-T的临床试验结果显示T细胞持续存在与肿瘤消退有很大的相关性。目前认为影响过继性转移T细胞持久性的因素有：患者的预处理、体外培养条件、T细胞衰竭、缺乏共刺激因子和宿主免疫应答。
2、T细胞功能障碍
T细胞效应功能的消失可能与内在（T细胞适应性）和外在（肿瘤微环境）有关。T细胞功能障碍包括T细胞无能、衰竭和衰老。功能性失调的T细胞，其增值和效应功能受损，还会表达各种免疫抑制性受体，例如PD-1，TIM-3，LAG-3，TIGIT和KLGR-1。在黑色素瘤患者中，从肿瘤中分离出来的大多数肿瘤反应性细胞都表达PD-1。
3、肿瘤异质性和抗原缺失
在临床前和临床研究中很多数据显示，由于抗原丢失、抗原表达的异源性和抗原呈递受损导致了肿瘤躲过免疫逃逸，这也被认为是临床失败的主要原因。
4、肿瘤污染
细胞治疗产品中的肿瘤污染与自体干细胞移植的复发有关。CD19-CAR-T细胞由外周血淋巴细胞产生，对于患有急性白血病的患者，白细胞母细胞通常在收集时存在于外周血中。通常在CD19-CAR-T细胞扩增结束，通过流式细胞术检测不到残留的B细胞母细胞，因为CD19-CAR-T细胞在体外能有效地清除它们。 然而，最近研究发现一名患有CD19-CAR-T细胞（CTL019）的患者，在输注后9个月后复发CD19阴性白血病，异常表达抗CD19 CAR蛋白，原因是在CD19-CAR-T细胞制造过程中，通过慢病毒转导，CD19-CAR-T基因被无意地引入单个白血病B细胞，所以在筛选工程T细胞时应提高免疫选择压力，避免肿瘤污染。
5、毒性
使用CD19-CAR-T细胞疗法，在一些B-ALL患者、B-CLL和B-NHL患者的中观察到CRS综合征，该综合征的特征在于细胞因子（IL-6、TNF-α等）、炎症外标志物（铁蛋白，C-反应蛋白）表达增加，还伴随发烧、低血压、肌痛和其他全身症状；另外在针对Her2/neu抗原的CAR-T细胞治疗中，虽然该抗原在肺中以低水平表达，但在一个早期试验中导致快速和致命的毒性；工程T细胞的脱靶导致对健康组织的破坏也是常见毒性之一。
6、实体瘤
与血液系统恶性肿瘤相比，固体肿瘤遭遇更复杂的障碍。首先，T细胞必须渗入实体瘤中，在实体瘤中受到免疫抑制环境的影响，例如免疫抑制细胞（调节性T细胞，肿瘤相关巨噬细胞，髓样抑制细胞）和一系列免疫抑制分子（PD-L1，IL-10，TGF-β）。另外许多具有免疫调节活性的酶在癌症患者中上调，一氧化氮等氮化物产生增加。这些情况都限制了T细胞活化，导致肿瘤特异性T细胞在肿瘤中的持久性降低而失去治疗效果。
7、个体化T细胞疗法成本高，价格昂贵
改善T细胞免疫治疗的策略
1、增强持久性
（1）通过优化CAR结构，可以有效影响T细胞的扩增和持久性。例如第二代CAR添加了共刺激结构域大大增强了T细胞的持久性和抗肿瘤作用，含有CD28和4-1BB共刺激结构域的CAR在临床中使用最广泛，研究表明，基于CD28的CAR具有较好的初始抗肿瘤作用，4-1BB信号传导可以增强CAR-T细胞持久性，而第三代CAR结合了两个共刺激结构域，将效力和长期持久性相结合。
（2）富集具有干细胞特性的T细胞，在较短的时间内完成扩增以减少T细胞的分化，改善T细胞在体内的持久性。
2、克服T细胞功能障碍
（1）保护过继性转移T细胞免受抑制信号的影响，例如利用基因编辑，敲除T细胞上的PD-1基因座或将CAR-T与免疫检查点抑制剂联合使用；
（2）优化CAR结构以调节表达，例如将CAR编码序列插入到阳性TCR基因座中，可以减少强直信号传导水平，延迟T细胞分化和衰竭；
3、克服抗原表达的缺失或抗原异质性
同时靶向多种抗原可以减少抗原阴性逃逸现象，例如使用双特异性性或三特异性CAR-T细胞治疗，结果显示多重靶向在预防抗原逃逸现象中十分有效。
在CD19阴性白血病的临床试验中，共定位CD19和CD123可以起到防止抗原丢失和治疗的效果。
4、利用细胞因子武装T细胞-TRUCKs
由于肿瘤是一种混合型的细胞群，而CAR-T细胞无法对这一群体中那些表面不表达靶抗原的细胞进行杀伤，为了能彻底清除肿瘤细胞，设计了一种新型工程化T细胞-TRUCKs，这种被改造后的T细胞可以在CAR识别靶抗原后，通过激活下游转录因子NFAT来诱导促炎性细胞因子IL-2，从而招募环境中的其他免疫细胞参与对不表达靶抗原的肿瘤的清除。此外，被募集的肿瘤附近的免疫细胞还可以通过分泌某些细胞因子来调节肿瘤附近的微环境，解除免疫抑制性。
5、减少毒性
减少毒性最主要的策略，增强T细胞对肿瘤特异性抗原的靶向性，减少对正常组织中表达的抗原的靶向作用，新型CAR-T设计可以减轻细胞毒性和解决逃逸问题（图3），其原理就是通过组合或者串联两种CAR-T，提高靶向的精确度，减少CAR-T的脱靶从而减少细胞毒性作用。
6、通用型CAR-T细胞
由于目前大部分的CAR-T细胞都是利用患者自身的T细胞来产生的，属于个体化产物，产生定制T细胞是一个昂贵且耗时的过程。除此之外，每种CAR具有固定的抗原特异性，每种CAR-T制剂仅能靶向特定的表位，因此科学家们致力于开发一种通用型CAR-T细胞，生产一种现成的即用型治疗剂。生产通用CAR-T细胞的设计原则是从同种异体健康受体产生肿瘤抗原特异性T细胞，通过基因编辑的方法破坏T细胞的TCR基因和HLAⅠ类基因，消除移植物抗宿主病（GVDH）。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9是比较常用的基因编辑手段。
总结：过继性免疫治疗ACT领域正在快速的发展，科学界对如何提高T细胞杀伤效率、减少T细胞衰竭、优化T细胞的生成、开发通用T细胞、降低临床毒性、避免肿瘤微环境免疫抑制等问题也正在进行深入的研究。目前ACT在一些癌症领域中取得较好的结果，生产通用型CAR-T细胞有望扩大其在不同癌症中的应用范围。
参考文献：
Sonia Guedan. Marco Ruella.et al. Emerging Cellular Therapies for Cancer. Annual Review of Immunology. 2018.11:7. https://doi.org/10.1146/annurev-immunol-042718-041407.
