| 实验步骤 | 对于萤光素酶的检测来说，需要解决荧光素渗透进入活体组织这一问题 [7]。多数情况下，用荧光素溶液简单地喷洒植物就可以解决，但是一些组织，如发育后期的种子不能吸收荧光素，需要产生伤口（见 注 27 ) 以利于底物进入 [52, 53 ]。通过组织提取或者原位杂交的方法，植物中 LUC 活性的明显缺失应该很容易得到确定 [7, 54]。因为伤口会影响荧光素-O2 的动态平衡，即使是重复喷洒荧光素之后达到了平衡，也难于利用 LUC 来研究受创伤影响的基因表达。
尽管O2和Mg2+ 一般不会限制萤光素酶的活性，但是在特殊情况下，如植物组织被淹没时，O2 含量会成为限制因素，随之导致产光量的降低 [7]。生长在不同氧合水平下的细胞悬浮培养物被检测到不同水平的 LUC 活性。
1. 材料的准备
(1) 用喷雾器将 1~5 mmol/L 的 D- 萤光素水溶液直接喷洒到整个植株上，使其完全湿润（见注 2 7 ) 。100 mmol/L 的 D- 萤光素水溶液小份分装，-20℃ 保存，用前进行稀释。
(2) 在图像采集前的 24 h 、16 h 、4 h、2 h , 重复上述的萤光素喷洒实验。
2. LUC 的活体检测
捕捉低强度发射光最简单的方法是通过 X 射线或感光胶片将表达萤光素酶基因的整个植株压在 X 射线胶片上，就可以获得该植株的照片，尽管这种图片的分辨率不高，但是它显示了基因表达的位置。因此，对于大多数实验来说，必须要购买一台敏感性的 CCD 成像系统。常用的 CCD 系统有两种类型：慢速扫描液氮制冷 CCD 成像系统和增强 CCD 成伐系统。制冷 CCD 系统一般可以提供更高的时空分辨率 [9 ]，但它对超过 500 nm 的波长有更局的敏感性（见注 29) 。其中的一种成像系统是利用硅晶片，它能在受到光子轰击后发射出电子。一个单独的像素发出的电子通过电子方法进行定量，从而产生图像。发出的电子数以灰度等级单位（gsu) 表示。像 MetaMorph 这样的软件，能够将这些 gsu 值转换为边界值范围内的伪彩色图像，所以可以对设定区域的荧光水平进行定量。但实际上，很难得到整个植株的图像，因为叶片以及其他器官的方向也会影响检测的信号。图 3.1 (b ) 显示的是启动子- LUC 拟南芥转化植株茎、茎生叶、正在发育的花芽上部的表达情况。该照片是用 Princeton Instruments 公司生产的慢速扫描液氮制冷 CCD 成像系统配以尼康 50 mm 的镜头拍摄，曝光时间 3 min。它是一个伪彩色图像 ，由 MetaMorph 软件制作，蓝色代表低强度像素，红色代表高强度像素。
(1) 液氮冷却相机，达到 -120℃ 的工作温度（见注 30)。
(2) 在捕捉图像前的 10~20 min，用萤光素喷洒材料。
(3) 将植株或者离体的叶片、茎、根放在载物台上，开启后灯，对焦，根据说明捕捉图像。
(4) 关灯，将材料置于完全黑暗中 5~10 min (见注 31）。
(5) 在 1~30 min 捕捉图像（见注 32)。
(6) 利用图像软件计算图像的光强度（见注 33)。 展 |
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