光照强度对海洋绿藻脂和脂肪酸含量的影响实验
海洋微藻因富含AA、EPA和DHA等(n-3)PUFAs而备受关注。(n-3)PUFA的生理功能 包括增强机体免疫系统功能、预防和治疗多种心血管疾病、促进婴幼儿智力及脑发育等，尤其是其中的AA和EPA是前列腺素及衍生物的前列环素、凝血烷、白三 烯的天然前体，在机体的多种生理过程中起着重要的调节作用，因此微藻可作为人类的高级营养食品和药品。微藻在水产养殖业中还是浮游动物(轮虫、枝角类 等)、甲壳类、双壳类和幼龄鱼类的饵料，其中含有的EPA和DHA等海产动物所必需的脂肪酸(EFA)，能够提高其生长率和幼体的存活率。
海洋微藻的脂肪含量以及脂肪酸构成的数量和质量可随环境因子而改变，如培养基中的营养盐组成及比例、环 境条件(光照、温度、盐度等)、生长时期等。光照强度影响微藻的光合作用和生长，从而对其体内生化成分产生影响。关于光照强度对海洋微藻总脂含量和脂肪酸 组成的影响已有多个报道，但国内外对裂丝藻的研究尚未见报道。本文对1株裂丝藻和3株小球藻等4株海洋绿藻在不同光照强度培养时的相对生长率、总脂含量和 脂肪酸组成进行了测定，以期找出其生长和脂肪酸合成的最适光照条件，为微藻的不饱和脂肪酸研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
实验所用微藻藻种取自中国海洋大学微藻种质库：小球藻；杆状裂丝藻；
1.2 培养条件
对4个藻株作了不同光照强度(3000lx， 5000lx， 8000lx)的培养实验。每个光照强度水平设3个重复。其中海水经沉淀后用脱脂棉过滤，煮沸消毒。采用f/2培养基。实验于2L细口瓶中进行，连续充 气，连续光照，光照强度用光量子控制，盐度28，室温(20±1)℃。每天用血球计数板法计数细胞浓度。
1.3 微藻收获
微藻在指数生长末期4 000×g离心15 min收获，收集的藻泥经冷冻干燥后放入带塞试管中，充N2气-40℃保存。
1.4 相对生长率计算
利用下式计算相对生长率：
μ=(lnNt-lnN0) /T
式中，μ为每天的平均分裂速率；T为培养天数；N0为培养开始时的藻细胞数；Nt为培养T天后的藻细胞数。
1.5 总脂提取
总脂提取和测定按文献方法进行。
1.6 脂肪酸分析
样品处理及气相色谱分析按文献方法进行。取40mg左右样品于离心管中，加入体积分数为2∶1的氯仿/ 甲醇溶液，振荡后加入1 mL 2 mol?L-1NaOH-CH3OH溶液，充分振荡后在75℃水浴中加热15 min进行皂化，冷却后加入2mol?L-1HCl-CH3OH溶液，调pH≤2，在75℃水浴中加热15min，使其甲酯化，然后加入1mL正己烷振 荡，取上清液进行色谱分析。
气相色谱分析采用美国HP5890II型气相色谱仪，氢火焰离子化检测器，Coawax carbowax毛细管柱(30 m×Φ0. 25 mm)，进样口和检测器温度均为280℃，程序升温，载气为高纯氮，流速2 mL?min-1，进样量1μL。以面积归一划法得到各脂肪酸组分的相对百分含量。
1.7 数据处理
用SPSS 13. 0软件分别进行单因子方差分析和多重比较。P<0. 05表示有显著性差异。
2 结果
2.1 相对生长率
本文做了不同光照强度对4株海洋绿藻的相对生长率的影响，结果见表1。从表1可以看出，C97在中光强 (5000lx)下获得最大相对生长率，C19、C95和C102均在高光强(8000lx)下获得最大相对生长率，且相对生长率随光照强度的增加呈增加 趋势。单因子方差分析结果表明，光照强度对4株绿藻的相对生长率均有显著影响(P<0. 05)。
2.2 总脂含量
本文做了不同光照强度对4株绿藻的总脂含量的影响，结果见表2。从表2可以看出：C19的脂肪含量在低 -中光强(3000—5000lx)间变化不大，高光强下有所降低；C95的总脂含量随光照强度的升高略有降低；C97和C102的总脂含量随光照强度升 高而明显升高。单因子方差分析结果表明，光照强度对C95脂肪含量的影响没有显著性差异，而对C19、C97和C102的脂肪含量的影响有显著性差异 (P<0. 05)。多重比较结果表明：C19在高光照强度时总脂含量显著低于其它各组，低光照强度和中光照强度处理间没有显著性差异(12?9%—12. 7% )； C97和C102则分别在高光照强度时脂肪含量显著高于其它各组(分别为40. 6%和33. 3% )。
2.3 脂肪酸组成
本文做了3个光照强度水平(3000lx， 5000lx， 8000lx)对4株绿藻脂肪酸组成的影响，实验结果见表3。
由表3可知， 14∶0、16∶0、16∶1(n-7)、16∶4(n-3)、18∶1(n-9)、18∶3(n-3)、AA和EPA是4株绿藻的主要脂肪酸成份。小球 藻C95的EPA含量在中低光照强度下含量较高，C97和C102的EPA含量随光照强度的增加而明显降低， SFA和MUFA总量随光照强度的增加总体呈增加趋势。杆状裂丝藻C19的EPA含量随光照强度的增加呈现低—高—低趋势， SFA随光照强度的增加呈降低趋势，MUFA随光照强度的增加呈增加趋势。4株绿藻的20∶4n-6含量和PUFA总量均随光照强度的增加而降低。
单因子方差分析结果表明：光照强度对C19的14∶0、16∶0、EPA含量及SFA、MUFA和 PUFA总量的影响有显著性差异(P<0. 05)，对其他脂肪酸含量的影响没有显著性差异；光照强度对C95的16∶1(n-7)、AA、EPA含量及MUFA和PUFA总量的影响有显著性差异 (P<0. 05)，对其他脂肪酸含量的影响没有显著性差异；光照强度对C97的16∶0、16∶1(n-7)、16∶4(n-3)、18∶3(n-3)、EPA含量 及SFA和PUFA总量的影响有显著性差异(P<0. 05)，对其他脂肪酸含量的影响没有显著性差异；光照强度对C102的14∶0、16∶1(n-7)、16∶4(n-3)、EPA含量及SFA、MUFA 和PUFA总量的影响有显著性差异(P<0. 05)，对其他脂肪酸含量的影响没有显著性差异。
多重比较结果表明，C19的EPA含量在中光照强度水平显著高于其它处理(12.7% )，低光照强度和高光照强度处理间没有显著性差异；C95的EPA含量在高光照强度水平显著低于其它处理，低光照强度和中光照强度处理间没有显著性差异 (14.0%—14.7% )；C97和C102的EPA含量分别在低光照强度水平显著高于其它处理(分别为12.0%和10.5% )。C19的16∶0含量和C95的AA含量在低光照强度水平显著高于其它处理；C19、C95和C102的16∶1n-7含量、C97的16∶0含量均 在高光照强度水平显著高于其他处理，低光照强度和中光照强度处理间没有显著性差异；C19的AA含量在低光照强度水平显著高于其它处理，中光照强度和高光 照强度处理间没有显著性差异；C97的16∶1(n-7)含量在低光照强度水平显著低于其它处理，中光照强度和高光照强度处理间没有显著性差异；C95和 C102的18∶1(n-9)含量在中光照强度和高光照强度处理间有显著性差异，其它处理间没有显著性差异；C97的AA含量和C102的16∶0含量在 低光照强度和高光照强度处理间有显著性差异，其它处理间没有显著性差异。4株绿藻的16∶4(n-3)、18∶2(n-6)和18∶3(n-3)含量较 低。C19的SFA和PUFA总量分别在高光照强度水平显著低于其它处理，在低光照强度和中光照强度处理间没有显著性差异(分别为41. 9%—42. 1%和19. 1%—19. 4% )；MUFA总量则在低光照强度水平显著低于其它处理，在中光照强度和高光照强度处理间没有显著性差异(38.6%—39.2% )。在高光照强度水平，C97和C102的SFA总量(分别为42. 2%和43. 0% )及C95和C102的MUFA总量(分别为39.8%和42.3% )均显著高于其它处理； C97和C102的PUFA总量均在低光照强度水平显著高于其它处理(分别为19.2%和18.9% )，C95的PUFA总量则在高光照强度水平显著低于其它处理，在低光照强度和中光照强度处理间保持稳定(均为21.3% )。
3 讨论
微藻的脂肪酸组成在不同的培养条件下可能会有所变化，但仍保持其特殊的特征。绿藻纲富含16碳和18碳 PUFAs，其特征脂肪酸是16∶4(n-3)和18∶3(n-3)，一些海产小球藻种有着较高含量的EPA，大多数的绿藻种类都仅含有少量的DHA或不 含。在本实验结果中， 4株海洋绿藻的主要脂肪酸组成为14∶0、16∶0、16∶1(n-7)、16∶4(n-3)、18∶1(n-9)、18∶3(n-3)、AA和EPA， 与前人的研究结果相符。
微藻的脂类物质包括中性脂(三酰甘油)和极性脂(磷脂和甘油脂)，三酰甘油通常含有更多的饱和与单不饱 和脂肪酸，甘油脂则含有较多的PUFAs，磷脂的含量相对稳定。微藻细胞随环境变化而改变各类脂的比例，从而也改变了脂肪酸的组成，光是其中最重要的因子 之一。在Thompson等的研究结果中，球等鞭金藻的总脂含量在较低光强取得最大值，绿色巴夫藻的总脂含量则随光照强度的增加(1120— 18000lx)由低—高—低—高变化，在3520lx和18000lx光强下总脂含量最高。李荷芳等的结果表明小球藻的脂肪含量与光照强度呈正相关，而 前沟藻的脂肪含量随光照强度的升高反而下降。石娟等和EmdadiD等的研究也表明微藻在低光照下脂肪含量较高。本实验结果中，C19的脂肪含量在高光强 下有所降低，C95的总脂含量随光照强度变化不大， C97和C102的总脂含量则随光照强度升高而明显升高，表明微藻的脂肪含量随光照强度的变化因种而异。
早期的研究结果表明光照强度的增加有利于海洋微藻16碳和18碳PUFAs的形成，主要是 16∶2(n-6)，16∶3(n-6)， 16∶4(n-3)， 18∶2(n-6)和18∶3(n-3)，LeeYK等的结果也表明紫球藻的18∶2、20∶4和20∶5含量随光照强度的增加而增加， Seto等的结果表明微小小球藻的EPA含量随光照强度的增加略有增加。但更多的研究表明，生长在高光强条件下的微藻不饱和脂肪酸的比例降低。 Renaud等认为这是由于不同的微藻细胞中存在不同类型的去饱和酶，而这些酶的活性受光强的影响不同，并研究了不同光照条件下等鞭金藻和微绿球藻的脂肪 酸组成，结果显示，Isochrysissp.的EPA等几种PUFA含量和N. oculata中的16∶2(n-4)、18∶3(n-3)、EPA含量及PUFA总量均随光照增加而下降。在Sukenik等的研究结果中微绿球藻的 AA、EPA含量、Molina-Grima等的研究结果中I. galbana的EPA含量以及Mortenson等的结果中纤细角毛藻(Chaetocerosgracilis)的16∶2(n-7)、 18∶1(n-9)、18∶2(n-6)、18∶4(n-3)、AA和DHA含量均在高光强下比例降低，Thompson等的结果显示当光强从 18000lx下降到480lx时，简单角毛藻中的EPA从6.1%增加到15.5%，而DHA从9.7%减少到3.6%。孙利芹等的研究结果表明中低光 照有利于紫球藻AA和EPA的积累。廖启斌等对三角褐指藻和小球藻、徐年军等等对后棘藻、蒋霞敏对微绿球藻和绿色巴夫藻、缪锦来等对两种南极绿藻以及 LiangY等对三角褐指藻等6株海洋硅藻的研究中也发现PUFAs含量随光强的增加而呈下降趋势。
在本实验结果中，小球藻C95的EPA含量在中低光照强度下含量较高，分别为14.0%和14.7%， 高光照下降低至7. 3%，与孙利芹等的研究结果相似；C97和C102的EPA含量随光照强度的增加而明显降低，C97从12. 0%降至8.1%，C102从10. 5%降至6. 2%，与Thompson等、Renaud等、Sukenik等、Grima等和Mortenson等的结果相似。C19的EPA含量随光照强度的增加呈 现低—高—低趋势(9. 1%—12.7%—9.0% )，表明杆状裂丝藻在中等光照强度下能够获得EPA的最大值。4株绿藻的AA含量均随光照强度的增加而降低，与Sukenik等和Mortenson等的 结果一致，4株绿藻的PUFA总量均随光照强度的增加而降低，与廖启斌等、徐年军等、蒋霞敏、缪锦来等及LiangY等的结果一致。产生这种变化的原因一 方面可能是由于微藻细胞在高光照条件下生长快速，体内的PUFA得不到足够的积累所致；另一方面还可能跟细胞内光合作用的机构有关，微藻细胞内的光合作用 在叶绿体的类囊体膜上进行，富含PUFA的甘油脂是类囊体膜的主要组分，其数量与细胞的光合活力密切相关。低光照条件下，为了增加光吸收及光利用效率，膜 脂的合成速率维持在较高水平，类囊体膜的表面积有所增加，因而PUFA含量增加。而当光强超过饱和光强时，引起了光合机构的损伤和光合速率的下降，膜脂合 成速率降低，甚至受到破坏， PUFA含量随之下降。
