土壤微生物总DNA的提取方法比较
实验概要
通过对比不同DNA提取及纯化方法,选择和优化适合于土壤样品不同分子量DNA提取及纯化的技术路线。
实验原理
土壤是微生物最大的栖息地,20世纪80年代,微生物学家采用免培养(culture-in-dependent)方法,即直接从土壤中提取微生物总DNA的技术,使得在基因水平研究这些未培养微生物的存在、群落结构和功能等情况成为可能。从环境样品中直接提取和纯化微生物总DNA是在分子水平上研究未培养微生物基因资源的关键。从环境样品中提取核酸通常有两种方法:直接裂解法(也称为原位裂解法)和间接裂解法(也称为异位裂解法)。直接裂解法是先在原位将细胞裂解后直接从土壤样品中提取DNA。间接裂解法是先把细菌细胞和土壤颗粒分开,然后裂解细胞,提取DNA,最后进行纯化。就DNA产量、分子操作所需要的DNA纯度和微生物多样性的代表性而言,两种方法各有优缺点。
主要试剂
DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0)
蛋白酶K(25 mg/mL)
溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0)
20% SDS
氯仿:异戊醇(24:1)
异丙醇
70%乙醇
RNAse 20 mg/mL
TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)
Nycodenz(Axis-Shield, Oslo, Norway;8 g Nycodenz溶于10 mL灭菌蒸馏水)
主要设备
50mL和1.5 mL离心管
水浴锅
高速离心机
涡旋器
实验材料
土壤样品
实验步骤
1. 直接法
(1) 称取1 g土壤样品,置于50 mL灭菌的离心管中;
(2) 加入13.5 mL DNA提取缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0),混匀后加入100 μL蛋白酶K(25 mg/mL)和200 μL溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0),37℃水浴30 min,每隔10 min颠倒混匀;
(3) 加入2 mL 20% SDS,65℃水浴2 h,每隔20 min颠倒混匀;
(4) 8 000 r/min室温离心15 min,取上清,用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次;
(5) 水相中加入0.6倍体积的异丙醇,4℃沉淀过夜;
(6) 11 000 r/min 4℃离心20 min收集DNA沉淀;
(7) 70%乙醇漂洗两次,干燥后用100 μL ddH2O(含RNAse 20 mg/mL)溶解,转入1.5 mL离心管。
2. PVP预处理直接法
(1) 取1 g土样,置于50mL灭菌的离心管中;
(2) 加入10 mL TENP缓冲液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)悬浮土样,200转摇床振荡10min充分混匀;
(3) 10 000 r/min离心5 min,弃上清,重复洗涤多次至上清基本为无色;
(4) 用5 mL PBS缓冲液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)漂洗一次;
(5) 沉淀按照1直接法提取DNA。
3. Nycodenz密度梯度离心间接法
(1) 称取1 g土样,置于50 mL灭菌的离心管中;
(2) 加入15 mL预冷蒸馏水,涡旋混匀;
(3) 用移液枪将10 mL Nycodenz(Axis-Shield, Oslo, Norway;8 g Nycodenz溶于10 mL灭菌蒸馏水)轻轻泵入土壤悬液底部,11 000 r/min,4℃离心30 min;
(4) 小心收集在Nycodenz-土壤混合颗粒和上层水层分界面的液体,加入10 mL灭菌蒸馏水重悬,10 000 r/min 4℃离心20 min去除含有Nycodenz溶液的上清液;
(5) 沉淀按照2.2.2.1直接法提取DNA。
4. 结合差速离心的Nycodenz密度梯度离心间接法
(1) 称取100 g土样,加入150 mL预冷蒸馏水,搅拌混匀,双层纱布过滤后700 r/min,4℃离心5 min,收集上清;
(2) 沉淀再经过两次重悬和离心,合并所有的上清;
(3) 10 000 r/min,4℃离心10 min后弃上清,沉淀用15 mL 0.8% NaCl重悬;
(4) 将10 mL Nycodenz(8 g Nycodenz溶于10 mL灭菌蒸馏水)加入土壤悬液底部, 11 000 r/min,4℃离心30 min;
(5) 小心收集在Nycodenz-土壤混合颗粒和上层水层分界面上的白色细胞层,加入10 mL灭菌蒸馏水重悬,10 000 r/min 4℃离心20 min去除含有Nycodenz溶液的上清液;
(6) 沉淀按照直接法提取DNA。