蛋白质分析技术(WesternBlot ELISA免疫荧光与免疫组化技术)-4
四免疫组织化学技术
原理：
是指酶标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的成色反应，对相应的抗原进行定性、定位和定量测定的一项技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙的结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜等）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等），并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。
免疫组化染色技术的分类
免疫荧光法（Immunofluorescence technique）
免疫酶法（Immunoperoxidase technique）
免疫金银法（（Immunogold technique）
ABC法（ Avidin-Biotin Complex）
五 蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术
1 GST融合蛋白进行Pulldow实验
（1）原理
细菌表达的谷胱甘肽s－转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。
两种应用：
1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用
2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用
（2）方法：
1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白）
2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4ºC 2h
3）离心弃上清
4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，离心
5）取上清进行SDS-PAGE电泳，
6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白
该实验设立GST对照，反应均在4ºC进行
2 免疫共沉淀
（1）原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档
缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用
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