直接或间接western blot检测方法之抗体介绍
直接western blot检测方法
在直接检测方法中，酶直接连接到一抗上(图1.5)。操作简单，检测步骤少。虽然直接检测是快速和直接的，但它往往比间接检测的灵敏度低，因为在这个过程中可以发生信号放大的步骤更少。此外，酶直接标记到一抗上可能会造成成本和资源上的限制。
间接western blot检测方法
间接检测方法比直接检测方法更受欢迎，主要是灵敏度更高。通过间接检测，识别感兴趣的抗原的抗体，称为一抗，(图1.5)。检测是通过添加标记的二抗实现的，二抗可以识别一抗上的特定表位。这种表位通常是种属特异性的；例如，在兔体内产生的几种不同的一抗都可以被同一种抗兔二抗体所识别。
当多个二抗与单一一抗结合，这使得检测灵敏度提高，还增加了检测的灵活性，因为用于检测二抗的标签的类型可以轻松更改。
抗体质量和种类
影响Western blot结果的主要因素之一是抗体的质量，尤其是一抗的质量。高质量的抗体-具有高特异性、高结合亲和力和低背景-增加了检测的特异性和敏感性，单克隆和多克隆一抗均可用。
一抗
多克隆抗体-多克隆抗体是利用机体对感兴趣的抗原的免疫反应获得的。它们直接从免疫动物的血清中分离出来，通常是兔子、山羊、驴或绵羊，因此是动物产生的所有抗体的复杂混合物。在免疫应答过程中，单个B细胞产生抗体，这种抗体可以识别抗原上的特定表位，不同的B细胞产生的抗体可以识别不同的表位。由于多克隆抗体识别抗原上的不同位点，多个抗体可以同时与抗原结合，使得多克隆抗体比单克隆抗体更敏感。然而，这种广泛的结合特异性有时会导致多克隆抗体具有更高的背景信号。
单克隆抗体-单克隆抗体是从杂交瘤细胞系的上清液中收集而来的，杂交瘤细胞系是将单个抗体合成细胞与骨髓瘤细胞融合而成的细胞系。这些细胞系通常来源于小鼠或大鼠。由于使用的是单一的抗体产生细胞或克隆，杂交瘤细胞系产生的抗体相同，都能识别抗原上相同的表位。单克隆抗体比多克隆抗体信号弱，因为单克隆抗体只与单个蛋白结合。
二抗
有多种类型的二抗可用于Western blotting检测，使用的二抗类型取决于一抗的种类和类别、检测方法等考虑因素。
一抗的种类——单克隆一抗的种类和类型通常来源于小鼠或大鼠细胞，而多克隆抗体可从多种动物中分离得到。二抗必须对一抗物种具有识别特异性。因此，抗小鼠或大鼠的二抗必须与单克隆抗体同时使用，而从兔体内分离出一抗时，则应使用抗兔二抗。根据组成抗体的重链分子和轻链分子的类型，抗体可以分为不同的类和亚型(也称为同型)。二抗必须与一抗类别或亚型相匹配，以便进行适当的识别。可以购买能够识别所有类别(即所有小鼠IgG抗体)或特定类别(如小鼠IgG2a)的二抗。具有特定亚型的二抗对于同时检测多个蛋白也很有用，因为每个二抗可以有不同的标签。
特异性二抗
Anti H+L—抗重链和轻链抗体(H+L)对目标蛋白的重链和轻链部分都具有特异性。当一抗的种类未知时，通常使用这种类型的二抗。
轻链特异性-当免疫沉淀后进行Western blotting，通常使用只识别抗体轻链部分的抗体。使用该抗体可防止识别沉淀抗体的重链。
抗体纯化
一抗和二抗均可纯化减少背景信号
亲和纯化——亲和纯化使用亲和柱来去除不与所需表位结合的抗体。亲和纯化抗体具有更高的特异性，因为存在较少的目标外结合抗体。
预吸附-预吸附抗体也可以用来提高结合的特异性和减少交叉反应。例如，兔抗IgG抗体可能被预先吸附在小鼠、大鼠和山羊的IgG上，以防止识别其他种类的IgG。预吸附抗体具有很高的特异性，推荐用于多重Western blotting。
抗体标记
在选择一抗(直接检测)或二抗(间接检测)抗体时，一个重要的考虑因素是与抗体结合的标签类型。酶标记(用于化学发光或胶片检测)、荧光标记或其他用于放大信号的小分子(生物素)。
酶标记-最常用的两种酶是碱性磷酸酶(AP)和辣根过氧化物酶(HRP)。许多抗体都可以使用酶标记，这使得此类抗体非常受欢迎。由于是酶促反应，必须控制曝光来采集信号。化学发光具有过饱和限制，限制了检测的动态范围。
荧光标记——检测抗体也可以直接用荧光基团标记，使用荧光检测系统进行检测。在适当波长的光激发下，荧光基团发出稍长波长的光。然后发射的光被成像仪捕获并转换成数字信号。与依赖酶的检测方法不同，荧光基团发出的光是一致的，并且与膜上的蛋白量成正比，从而达到精准定量。
其它标记物-生物素标记的抗体可用于对低丰度蛋白的灵敏检测。该系统依赖于生物素与荧光标记(或化学发光标记)亲和素/链霉亲和素之间的强结合作用。检测抗体通常与多个生物素分子结合，当多个标记的亲和素/链霉亲和素分子与生物素分子结合时，会产生强信号。
