四、转膜
以下以使用半干转膜为例。对于转印90kd以下的蛋白，转膜液都不用加SDS，如果是蛋白分子量大的话可以加入0.037%的SDS。
在电泳结束前20min开始准备转膜所需的东西。转一张膜需准备6张的滤纸（长一般为8.1~8.3cm，宽度根据裁的胶大小实际测量，但胶一般会缩水，所以裁8cm就行）和1张PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。PVDF膜使用前用无水甲醇中浸泡1min~2min。目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
2. 将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲，效果出奇的好）。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。也可取10ml注射器吸满转印缓冲液，往玻璃板与凝胶之间注水，使液体的压力将两者自然分开。取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。之后有两种方法供选择，一是按照marker指示，把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来，二是把整张胶转膜，前一种方法更加节约材料，但操作稍微麻烦了一点。在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的PVDF膜和滤纸，平衡10min左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的SDS。
3. 带上手套，平放转移槽的底座，依次在石墨电极上叠放3张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF膜（此时可在PVDF右上角减去一个角，以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面）、刚刚完成电泳的凝胶和另外3张浸泡过缓冲液的滤纸。用枪头或移液管在叠层的滤纸上滚动，除去气泡。注意每叠一层就要用玻璃棒或圆筒试管赶去气泡，因为一个气泡的厚度对于蛋白来说都是十万八千里的。用干净纱布将叠层上面和周围的多余缓冲液吸干（这一步很重要，宁可太干也不能太湿，太干容易烧胡，太湿的话多余的缓冲液会导致电流短路，大大降低转移效率，如果同时转好几条胶的时候更要小心，有一个胶短路就会影响整体的转移效率）。最后将转移槽的上盖扣上，接通电源开始转膜。由于设备昂贵，第一次操作应向熟手请教，否则短路可能烧坏设备！转完后立即清洗设备，特别是金属上盖，转膜液特别容易在金属上盖上形成结痂，影响设备的正常使用，我们实验室今年做western的同志因为忽略这一点，转膜仪烧坏了好几次。
4. 依据分子量大小电泳15~60min。如果初次转膜，可以根据一般经验，即多少kD的蛋白就转多少分钟，再根据结果调整时间。之后断开电源，取出转移膜进行后继实验。
5. 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染。传统方法是将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。实际上更常用且简便的方法是先将膜晾干，然后浸入20%的甲醇，待完全浸湿后取出透光观察即可看到蛋白条带（此方法仅仅适合PVDF膜）。将膜晾干备用。使用预染marker话可以看见marker的颜色转印到了膜上，但是凭借这个颜色来判断是否转印完全或转印过头是不可靠的。
五、免疫杂交反应
1. 将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h即可。如果是自己配置的封闭液，最好过滤一下以消除固体杂质。实际经验表明与其封闭过夜，不如一抗孵育过夜。
2. 将一抗用封闭液稀释（一般用封闭液稀释即可，如果背景不高用TBST稀释也可以，当然熟练后还可以自由发挥，配制一些自己的复方稀释液）至适当浓度（可以在1.5mlEP管中配置工作液，常用稀释倍数为1:200，1:500，1:1000，具体需要预实验进行摸索，用后可回收重复用2~3次，但回收重复利用的效果如何就要看抗体的质量，分装的抗体不推荐回收。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡（也可使用手术室的病理袋，质量不错，减去下面的折叠部分，用封口器（40~80元一个）封上，不漏液即可）。37°孵育1h之后转移到室温下再孵育1h（或者4°孵育过夜），用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。也可以多洗几次，比如4次，每次5min。
3. 在培养皿内加入二抗稀释液（10ml足够了，一般1:1000甚至1:10000用TBST稀释），放在摇床上，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。选择好一个合适的条件不要轻易改变，另外相比一抗，二抗作用的时间应严格控制，实践证明一抗时间长点可能没什么关系，而二抗时间若过长过短都将会直接影响结果。二抗孵育之后还要注意好好洗涤，否则显影是背景可能脏。
六、化学发光（ECL）
现在工作台上铺一张保鲜膜，将PVDF膜放在保鲜膜上。将ECL的A和B两种试剂在EP管内等体积混合（注意吸完A试剂后吸B试剂前要患枪头），然后均匀滴在PVDF膜的蛋白面，反应1~2min后，将PVDF膜上多余的ECL工作液吸干，之后转移到在X片夹中预先铺好的保鲜膜上一侧，把另一侧翻过来盖在其上。用透明胶把保鲜膜固定在片夹上。
七、凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值，比如bio-rad的Quantity One。
主要参考资料：
1、WB实战指南+正确使用Quantity One定量 by jacqueslm2001 http://protein.dxy.cn/bbs/topic/17898080
2、Abcam的western新手指南 http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/?WB-beginner.pdf
3、土豆网的western blot视频 上海交大出品 http://www.tudou.com/programs/view/MjbxGQJ2kRU/
4、《分子克隆实验指南》精编版 化学工业出版社
5、《抗体技术实验指南》科学技术出版社
6、milipore的western blot的优化方案 http://www.dxy.cn/upload/2010/millipore/index.html
7、Western blot步步看(网络流传最广的资料) 作者不详 http://protein.dxy.cn/bbs/topic/21950829
8、Bio-rad 蛋白印迹手册 http://www.dxy.cn/bbs/thread/21360641#21360641
9、穷人的劳斯莱斯-我的五年western blot体会 by seagatehttp://protein.dxy.cn/bbs/thread/18102961#18102961
附：Western Blot Quick Guide（以及一天跑完Western的时间规划）
前期准备：蛋白已经定量，各样本已经稀释到某固定浓度，已经和SDS loading buffer混合，已经分装好，保存与-20°。头天下午或晚上配胶，分离胶和浓缩胶一起配好，带上梳子，放入潮湿的自封袋内放入4°冰箱备用。
8:00 从冰箱里取出蛋白样品，用PCR仪95度加热5min。混合均匀并离心。
8:30 取出昨晚配好的胶，组合，加电泳液。在电泳液里拔梳子能稍微容易一些。用10ul的枪加样。
9:00 开始电泳。恒流30mA一般1个小时足够了。
9:30 开始准备转膜用的滤纸和PVDF膜，PVDF膜泡甲醇。一般8cm的宽是固定的，所以如果要裁胶的话可以先大概估计一下。
10:10 电泳结束（假设电泳用了70分钟），起开玻璃板，裁出胶上所要的条带，如果整块胶转就更方便了。把胶放在盛有转膜缓冲液的培养皿里。
11:00 转膜开始（这里裁纸和铺三明治还是比较费时间的，我一般要用30分钟到50min，所以这里要抓紧时间）。
12:00 转膜结束（这里按60min的半干转的时间来计算）。开始封闭1h。
13:00 封闭结束，开始孵育一抗（在这里你可以选择一抗孵育过夜，如果不过夜的那一天就能结束），如果不过夜的话我一般选择37° 1h然后在室温（23°左右）再1h。
15:00 一抗孵育结束。TBST洗涤3*10min或者5*6min。
15:30 开始孵育二抗。室温1h足够了。
16:30 二抗孵育结束。TBST洗涤3*10min或者5*6min，这里推荐采用5*6min。
17:00 ECL发光，拍照，结束战斗了。
