Western blot常用封闭液及注意事项
在做Western blot实验中，会用到固相载体（如NC膜，PVDF膜），在这些固相载体表面有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到膜上，蛋白以机械填补（堆积）和吸附的方式结合于表面。蛋白塞进了表面的很多洞洞里面，但是蛋白并不是连续的，而有很多空隙，抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异性的信号。 封闭液中的蛋白可以与固相载体表面的空白位置结合，同样以机械填补（堆积）和吸附覆盖的方式结合在膜上，因为有“填补”和覆盖“蛋白结合位点以避免一抗的非特异性结合，所以有”封闭“的说法。同样这两种作用使封闭液中的蛋白能够狠牢固的结合在空白位置上，这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。 封闭液应封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白，不结合靶蛋白表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。 常见的封闭液： |
| BSA |
BSA是最常用的封闭液，成分单一适用于大多数情况。若免疫原是偶联BSA的，BSA有很强的免疫原性，会导致产生很多针对BSA的抗体，为避免交叉反应，不能用BSA，脱脂奶粉封闭，可以选用酪蛋白或无蛋白的封闭液。 |
| 血清 |
封闭血清的原理主要有两点，第一是待测样本有些与蛋白非特异性结合的物质，从而导致背景过高，因此可以用BSA或血清封闭掉这部分分特异性的结合，从这点看，BSA和血清没有明显区别。第二待测样品中可能会有Fc受体，可以和抗体恒定区结合，与抗体特异性无关，封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间的结合，BSA无法封闭Fc受体。 |
| 脱脂奶粉 |
脱脂奶粉最大的优点是价格便宜，但由于成分相对复杂，所以适用范围要狭窄一些。磷酸化抗体也许会导致背景增加，此外，因为自身含有生物素，不能用于生物素标记的抗体系统。脱脂奶粉种含有少量的生物素和碱性磷酸酶残留，在使用生物素-亲和素系统和碱性磷酸酶标记的二抗时，也会使得高背景或本底水平增高。 |
