三维细胞培养技术及其相关载体的研究进展及应用（一）
经3D细胞培养支架培养的骨髓间冲质干细胞图片--复蒙基因
自WillhelmRoux于1885年从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞培养, 单层细胞培养技术已有百余年的历史。一个多世纪以来,单层细胞培养有了蓬勃的发展, 特别是在制药或者疫苗合成等产业化领域, 通过细胞的快速分裂,从而高效率地制造产品。但在生命科学基础研究领域, 对于细胞的体外培养, 关注的不仅仅是它们的分裂生长,而更为重要的是它们经过传代后能否维持体内的性状。在很多情况下, 单层细胞培养技术所取到的研究结果和体内的情况不符合,因为细胞在体外改变的环境下增生, 逐渐丧失了原有的性状。动物实验完全在体内进行,但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化, 难以研究单一过程。另外, 我们在动物身上所观察到的结果,往往是最终呈现的表现, 而非研究者最为关心的中间过程。显然, 如何填补单层细胞培养和动物实验的鸿沟,一直是生命科学家思索的问题。尤其是在发育生物学领域, 迫切需要建立一套细胞培养技术, 既能生长传代, 还能最大程度地维持体内性状,并分化产生新的组织结构, 以便全面研究发育过程。随着组织工程的新兴发展, 三维细胞培养技术就应运而生了。
1 什么是三维细胞培养技术
体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境,该模拟系统中最重要的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。不同于传统的二维化单层细胞培养, 三维细胞培养技术(three-dimensional cell culture, TDCC)是指将具有三维结构的不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养, 使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞-载体复合物。三维细胞培养是将细胞培植在一定的细胞外基质中, 细胞外基质( extracellular matrix,ECM) 蛋白充当生长支架, 使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构, 所创建的细胞生长环境,则最大程度地模拟体内环境。TDCC作为体外单层细胞系统的研究与组织器官及整体研究的桥梁,显示了它既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础,又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。近几年三维细胞培养技术在组织形成、血管发育和器官再造等发育生物学的分支领域得到了广泛的应用;同时在筛选新药的疗效分析和毒理实验方面, 利用三维培养获得了和二维单层培养完全不同的结果, 引起了药物学家的极大兴趣。
2 三维细胞培养支架材料
细胞赖以生存的三维空间，其功能是为细胞提供生存空间，使细胞获得足够的营养物质进行气体交换，并使细胞按预制形态的三维支架生长，成为使细胞生长良好的三维界面。理想的生物支架材料应具备以下特点：良好的生物相容性、可降解性、足够的孔隙结构、促进细胞黏附与增殖、具备承载生长因子的能力、支架的容积应能保持不变、支架能与周围组织融为一体、不易从缺损区脱落、具有一定的弹性、具有关节软骨的分层结构。常用的支架材料有：天然生物材料、人工合成高分子材料、无机材料以及这些材料的复合物。
2.1天然高分子材料
天然生物材料主要包括：胶原、明胶、纤维蛋白、壳聚糖、琼脂、糖胺多糖(如：透明质酸、硫酸软骨素等)、藻酸盐、蚕丝蛋白、松质骨骨基质、脱细胞基质等。天然支架的优势在于有利于细胞包埋，抗原性低、无毒性、无致炎性、能促进细胞生长和粘附等。但天然材料的缺点是机械性能差，一方面不适应塑性的需要，另一方面，在体内水解过程中不能保持空间构型并且吸收过快，其应用受到限制。再者，天然材料每批之间都有差别，难以大批量加工生产。
目前，市场上商品化的三维支架产品多以Matrigel、胶原复合物为主。胶原是天然蛋白质的一种，广泛存在于动物的皮肤、骨、软骨、牙齿、肌脾韧带和血管中，占人体蛋白质总量的30%以上，是结缔组织极重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能。胶原一般是白色透明、无分支的原纤维，它的周围是由多糖和其他蛋白质构成的基质。胶原蛋白分子肽链上具有多种反应基团，如羟基、羧基和氨基等，易于吸收和结合多种酶和细胞，实现固定化，它具有与酶和细胞亲合性好、适应性强的特点。胶原具有重要的生物学性质——力学性能高、促进细胞生长、止血、生物相容性和生物降解性。已有报导，胶原可以作为移植载体用于骨介入蛋白——骨形态基因蛋白2(rhBMP2)的载运。胶原现已被广泛应用于作为传送培养好的皮肤细胞和药物的载体，以进行皮肤替代和烧伤治疗。另外胶原是一种成膜性好的物质，并具有生物相容性，在体内可被逐步吸收，因此，胶原蛋白固定化酶特别适合于人工应用材料。但其同时也存在某些缺点，诸如难以规模制备，机械强度较差，对感染部位的疗效不显著等。商品化的胶原复合物支架有牛皮、鸡爪等来源。Matrigel是从小鼠肿瘤组织中提取的抽提物, 这为三维培养介导的针对人体的干细胞临床治疗带来了风险。
2.2 无机材料
目前常用的无机材料有羟基磷灰石、磷酸钙骨水泥、磷酸三钙等，此类材料主要应用于骨骼组织工程。
羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）是人体和动物骨骼的主要成分,这种材料的研究历史久远。HA脆性大、抗压性能比骨组织小，虽然植入体内后，由于组织、细胞的侵入，其强度会逐渐升高达到松质骨强度，但是有研究人员认为HA在体内吸收过慢，不利于愈合的骨骼承受应力和新骨形成。同羟基磷灰石相似，磷酸三钙(tricalciumphosphate,TCP)具有良好的生物相容性及可吸收性，但是缺乏孔隙、颗粒较小、易分解（6周）、脆性大及不耐压等缺点，限制了其应用。用磷酸钙、碳酸钙、磷酸三钙为原材料在室温下发生系列聚合反应合成磷酸钙骨水泥（calciumphosphatecement,CPC），这种化学复合物的晶体结构与天然骨相似，可以塑形，有良好的骨形态和力学特点，能够提供机械完整性。其孔隙率大约为50%，与羟基磷灰石相似，但脆性大，其降解时间较长，约需2年左右。另一方面，磷酸钙骨水泥材料内部的孔隙直径小于1mm，成骨速度慢，目前的研究重点是如何将其与大孔隙材料复合以提高吸收速度及加快成骨。
总的来说，此类材料具有较高的压缩强度、耐磨性和化学稳定性，并可在生物体内发生降解，被新生骨组织吸收和替代，是骨组织支架常使用的材料。但存在多孔体强度较差、加工困难、形成的支架孔隙率低、脆性大、组织不能完全长入等缺点。
