禽流感病毒的分离、鉴定和诊断
一、什么是禽流感？
禽流感（AI）是由A 型流感病毒（AIV ）引起的禽类疾病综合症。禽类感染AIV 后表现为：轻度上呼吸道感染、精神萎缩、食欲减退，有类似人类A 型流感的症状。初期还会引起肉用鸡停止增重，蛋鸡产蛋量大大下降，种蛋孵化率下降等。发病很急，很短时间就会发展到全身致死性疾病综合症。AIV 广泛存在于家禽和野生禽类，临床症状易与ND （Newcastle disease, 新城病毒）、IB（鸡传染性支气管炎）、EDS-76 （病毒引起的鸡产蛋下降综合症）相混淆。虽然AI 的毒株大部分都不是高致病力毒株，但由于A 型禽流感的抗原（特别是血凝素抗原）易发生变异，变异后的毒株会变成高致病力的病毒，造成严重危害。此外AI 还会传染给高危人类（如饲养者，运输者，禽医，禽类流行病专家等），造成人类禽流感，其危害更大。
二、历史：
人类在十九世纪前对禽流感没有深入认识和研究，当时禽类饲养也没形成大规模企业生产，一般小型饲养户把AI 统称为禽类瘟病，流行也是局部的，危害有限。但1878 年，意大利的AI 大规模流行（可能是高致病力毒株引起）到百年以后1983－84 年美国大流行（已经确认是高致病力毒株H5N2 引起）再到2004 年亚洲→美洲的大流行表明AI 发生了变异，它是由AIV 的纤突中血凝素（HA）的抗原发生变异形成的，和人类A（甲）型流感一样，仅仅是HA 抗原蛋白的一个氨基酸发生了变异就使得毒株的致病力发生了很大的变化。
现在，对禽流感的认识已经前进了一大步，AIV 的蛋白质、酶、和核酸种类及序列已被查明。禽流感疫苗已在各国生产。对AIV 的生物学诊断技术的研究已发展到了分子生物所阶段。在我国，正在研究制订流行病学检测方法和制订早期快速诊断技术规程。
三、AIV 的分离、鉴定和诊断：
I. 分离纯化和观测：
采集气管粘液或泄殖腔粘液，或病变组织（呼吸道、消化道），加纯水制作匀浆（10％ 悬液），低速冷冻离心机（台式或立式均可）3,000~4,000rpm, 4℃～5℃，15～20 分，弃沉淀，即得到粗制的病毒液，可用负染法处理（用毛细管吸取悬液，滴在带有支持膜的铜网上，根据悬液内样品的浓度可立即或放置数分钟后，用滤纸从液珠边缘吸去多余液体，然后滴上负染液（常用重金属盐配置：如PTA（磷钨酸）、KPT（磷钨酸钾）、NaPT ( 磷钨酸钠)、醋酸钠、甲酸钠、钼酸铵等等）、染色时间1～2 分钟，然后用滤纸吸去染液，待干燥后上透射电镜观测。
如果粗制液中病毒成份极少，透射电镜观测不到，则可把悬液用离心浓缩仪浓缩；或用超速离心机，固定角式转头40,000rpm ×45 分钟，5℃取沉淀制成悬液上电镜观测。或用40,000rpm 的甩平转头，30％～50％W/W 线性蔗糖梯度32,000rpm×50 分，5℃，病毒集聚在1.15～1.18g/cm3 之间的某个位置形成纯样品区带；或用Ficoll,30％～40％W/W 线性梯度，病毒沉降在1.13～1.15 g/cm3 之间；或用Percoll 作平衡等密度离心，自形成梯度，病毒悬液与Percoll 混合，初始密度1.05 g/cm3，用0.01M Tris-HCL 作渗透平衡液，超速离心甩平转头P28S（日立）或SW28（贝克曼）转头，20,000rpm×30 分钟，5℃。病毒在1.06 g/cm3 附近形成纯样品区带。当然，也可以用溴化钠（钾）或碘化钠（钾）梯度进行禽流感病毒的纯化。
对于一般单位，由于设备限制为了达到分离鉴定的目的可用下面程序：
病毒组织低速离心后的悬液，经过离心浓缩仪处理浓缩到原来体积的1/3~1/4 后接种于9～11 日龄鸡胚，每个鸡胚注射0.2ml,35℃±2℃培养三天。收集尿囊液及羊水测定其血凝活性，若为阴性则继续盲传2～3 代，对具有血凝活性的尿囊液先用ND（核抗原）抗血清作HI 试验以排除新城病毒（New Castle Virus ）的可能性。ND 阳性的样品也要采用中和法传代， 看看是否为ND 与AIV 混合感染。然后用免疫法来检测特异性核抗原NP 或MP，接着用血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验来鉴定A 型禽流感病毒亚型。分离鉴定的同时还要进行致病力试验，确定毒力强弱。
和人类流感致病病毒一样，病毒的分离、纯化、鉴定、诊断都是比较复杂的操作，但对于哺乳类脊椎动物来说，致病病毒有相当多具有构造相似、分离纯化方法也基本相同，但诊断技术就常有较大的差异。
纯化的病毒可用透射电镜作进一步观察研究，一般用负染或超薄切片选择较小的物镜光阑（增加反差），较高的加速电压（80～100）KV，放大倍数一般为15 万～20 万倍，可以清晰地观察到病毒形态。
病毒裂介和进一步对血凝素，神经氨酸酶，RNA 及其他蛋白质，酶进行分离纯化后，可进行病毒的部分基因或全基因序列测定，以鉴定病毒的变异程度和生产有效的疫苗。
II. 禽流感诊断技术：
禽流感诊断技术可分为血清学诊断技术和分子生物学诊断技术。
① 血清学诊断技术
l HA( 血凝素)HI（血凝素免疫）试验：常用于AIV 的HA 亚型鉴定的方法。试验繁琐，特异性好。但由于用已知HA 型的血清不能检出新的HA 亚型的AIV，所以该方法有一定局限性。l 神经氨酸酶抑制试验：（NW）：用于AIV 另一种表面抗原，即神经氨酸酶的亚型鉴别。80 年代后期已逐渐采用96 孔板微量NIT 试验法，此法不仅可降低Ag（抗原）用量，而且可以对多种分离物进行Ag 分类。WHO（世界卫生组织）推荐此法用于NA 亚型分类。用1－9 型NA 抗血清加入各种试剂，经实验处理后用颜色来鉴别NI 的阳性和阴性。根据结果可判断AIV 的NA 亚型。注意，为了避免病毒扩散污染危险，HA,HI,NIT 试验都必须在P2~P3 级试验室进行。
l 病毒中和试验（VNT）:试验操作繁琐，临床上很少使用，但作为经典方法，它可以作为其他新的检测方法的比较标准。
l 琼脂凝胶扩散试验（AGP）：AGP 是在琼脂凝胶中进行的抗原抗体免疫沉淀反应。简便、快捷，既可定性又可以定量，70 年代以后开始将AGP 用于禽流感Ab 检测。由于禽流感不同亚型均具有共同的型特异性Ag，保守性很强，基本不发生变异，所以可以用一种禽流感的Ag 或Ab 对所有A 型AIV 的Ab 及Ag 进行检测。AGP 常用免疫双扩散法。Ag 制备法可参考三I 节的悬液制备或用超速离心浓缩纯化，福尔马林灭活制备Ag 效果很好。在琼脂板中加入3％的PEG-6000，可以提高AGP 的敏感性。除以上方法外，免疫单辐射扩散试验、单辐射溶血试验，对流免疫电泳等也常用于AIV 及其Ab 的检测。但这几种试验都需在凝胶中进行，敏感性差。AGP 所需试剂及Ag，Ab 量较大，限制了它的使用。
l 免疫荧光技术（IFT）：60 年代开始用于人流感快速诊断，80 年代美国爆发了禽流感时，将IFT 首次用于AIV 检测。诊断时应注意避免或降低样品中出现的假阳性，即非特异性荧光问题。
l 酶联免疫吸附试验（ELISA）：80 年代开始用于AIV 亚型检测，20 年来各国学者对此法进行了多种研究和改进，已有试剂盒出售。目前ELISA 已成为AI 流行病学普查及早期快速诊断最有效，最实用的方法。
② 分子生物学诊断技术： 近年来，分子生物学技术已被大量应用于AI 的快速诊断。PCR ，和我国学者创建的逆转录－聚合酶链反应即RT-PCR 具有高度特异性和灵敏性。此外，用单克隆抗体在免疫过氧化酶染色组织中定位病毒抗原；基因探针原位染交可定位组织中参与病毒复制的感染细胞；核酸分子杂交可检测病毒的核酸等等都有很好的应用前景。
四、展望：
目前我国学者正在研究和完善禽流感的早期快速诊断技术和流行病学检测方法，已经在制定AI 诊断规程和防疫条例，并建立全国性的AI 检测和预防网络。
