亚细胞结构的分离与鉴定-1
细胞由各种亚细胞结构组成。其重要的研究手段之一是分离纯化亚细胞组分，观察它们的结构或进行生化分析。离心技术是实现这一目标的基本手段。一般认为，转速为10～25Kr/min的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kg者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。
第一节 亚细胞结构分离的技术
分离亚细胞组分的第一步是制备组织匀浆或细胞匀浆。匀浆（Homogenization）是在低温条件下，将组织或细胞放在匀浆器中加入等渗匀浆介质（即0.25moL/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙溶液）研磨，使细胞被机械地研碎成为各种亚细胞组分和包含物的混合物。
分离亚细胞组分的第一步是分级分离。它通过由低速到高速离心技术，使非均一混合体中的颗粒按其大小轻重分批沉降到离心管的不同部位，再分部收集，即可得到各种亚细胞组分。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时是均匀分布于整个离心管中，故每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。分离亚细胞组分主要离心技术是差速离心和密度梯度离心。
差速离心（differential centrifugation）是在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。
在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后为核糖体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，一般重复2～3次效果会好一些。通过差速离心可将细胞器初步分离，但常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。
密度梯度离心（density gradient centrifugation）
是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；
pH中性或易调为中性；浓度大时渗透压不大；对细胞无毒。①速度沉降（velocity
sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离；②等密度沉降（isopycnic
sedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。
等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。再者，这种方法所需要的力场通常比速度沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。因此，这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。
分离亚细胞组分的第三步是对分级分离得到的组分进行分析，以确认。常要的分析方法包括形态和功能鉴定。
第二节 细胞核与线粒体的分级分离
一、所需试剂及设备
小白鼠、冰块、玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25m1烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、蜡盘、平皿、牙签。0.25moL/L蔗糖一0.003mol/L
CaCl2溶液、1%甲苯胺兰染液、0.02%詹纳斯绿B染液、0.9%NaCl溶液。
附:溶液的配制：
1/300詹纳斯绿染液：
取詹纳斯绿1克，加Riger氏液300ml。现用现配。
1/3000中性红染液：
称取中性红 (Neutral red)O.1g，加蒸馏水300ml。室温保存.
Ringer Solution：
NaCl 0.9g
KCl 0.042g
CaCl2 0.025g
蒸馏水 100m1
0.25mol/L蔗糖一0.003mom/L氯化钙溶液：
蔗糖 85.5g
CaCl2 0.33g
蒸馏水 1000ml
二、操作步骤
（一）制备肝细胞匀浆
将小白鼠用颈椎脱位法处死，迅速开腹取肝，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中，反复洗涤，除去血污，用滤纸吸去表面的液体。
称取1g肝组织(湿重)放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25moL/L蔗糖—0.003mol/L
CaCl2溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全加入。剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3一5次，用8层纱布
(先用蔗糖液湿润)过滤匀浆于离心管中，然后制备涂片①，做好标记，自然干燥。
（二）分级分离与观察
1. 细胞核的分离提取与观察
将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15min；缓缓取上清液，移入高速离心管中，放在冰块中，待分离线粒体用；同时涂一张上清液片②，做好标记，自然干燥；余下的沉淀物进行下一步骤。
用6m1蔗糖一氯化钙溶液悬浮沉淀物，以250Orpm离心15min弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载片上，即涂片③，自然干燥。
将涂片①②③用1%甲苯胺兰染色后盖片即可观察。
2. 线粒体的分离提取与观察
将上述装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000rpm离心20min，弃上清，留取沉淀物。加入0.25moL/L蔗糖—0.003mol/L氯化钙溶液1m1，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20min，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入蔗糖一氯化钙溶液0.1ml混匀成悬液(可用牙签)。取上清液和沉淀悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④⑤涂片)，各滴一滴0.02%詹纳斯绿B染液盖上盖片染色20min。
油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。
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