基因工程的载体和工具酶-4
与II型核酸内切酶有关的几个概念
粘性末端：cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。
平 末 端 ：Blunt end在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。
同裂酶：isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。
同尾酶：isocaudamers识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如BamH I 、BclI、BglII和Xho I 是一组同尾酶。
注 意： 由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。
（五）限制性核酸内切酶的消化反应
一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，1h内中完全降解1 mg l DNA所需要的酶量。
影响酶活性的因素很多，最重要的有：
⑴ DNA的纯度
⑵ DNA的甲基化程度
⑶ 酶切反应的温度（通常为37℃ ）
⑷ DNA的分子结构
⑸ 核酸内切限制酶的缓冲液
在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性。用*表示。
二、 DNA连接酶及其应用
（一）DNA连接酶的发现
环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种切口的酶存在。
首个DNA连接酶(ligase)——大肠杆菌DNA连接酶，是1967年发现的，是大肠杆菌基因编码。
1970年，发现了T4DNA连接酶，由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。
（二） DNA连接酶作用特点
1. 连接的两条链必须分别具有自由3’－OH和5’－P，而且这两个基团彼此相邻；
2. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。
E.coli DNA连接酶 －连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。
T 4DNA连接酶－连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。
（三） DNA连接酶的反应条件
影响连接效率的因素有：
1. 温度（通常在4-15℃ ）
2. ATP的浓度(10μM／L - 1mM／L )
3. 连接酶浓度（一般平末端大约需1～2U，黏性末端仅需0.1U）
4. 反应时间（通常连接过夜）
5. 插入片段和载体片段的摩尔比（ 1∶1～5∶1）
（四）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案
1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1～5∶1），补足ddH2O 至8μl。
3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。
4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃）连接8-14hr。
三、DNA聚合酶及其应用
（一）大肠杆菌DNA聚合酶I
是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力：
5′→ 3′聚合酶活性（模板， 带3′－OH游离基团的引物、4dNTPs、 Mg2+ ）。
双链特异性的5'→3'核酸外切酶活性。
3'→5'核酸外切酶活性。
从游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。主要是校正作用。
大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途
1.利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针
利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。
2.用于DNA连接前的大缺口填充
利用5′--3′的聚合酶活性。
3.用于DNA的序列分析
利用5′--3′的聚合酶活性。
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