辣根过氧化物酶的实验原理
过氧化物酶催化以下反应：
2 H2O2 →O2+2H2O
这一类酶以铁卟啉为辅基，所以属血红素蛋白质类（hemeProteins）。过氧化物酶在生物界分布极广，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。
本实验是以辣根为原料，经过水的抽提，硫酸铵和丙酮分级分离，再经锌离子纯化，透析除盐，冷冻干燥，最后制得高纯度的辣根过氧化物酶。
辣根过氧化物酶分子量在40,000左右，是一种含亚铁血红素的蛋白质，等电点7.2；易溶于水，溶解度为5%（W/V），溶液呈棕红色，透明；也溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而0.62饱和度以上则不溶。该酶最适pH为7.0（对愈创木酚为氢给体而言）。在室温下HRP在几周内保持稳定，加热到63℃后15分钟内稳定。
辣根过氧化物酶氧化还原电势很低，pH6.08时，E’0= -0.2070V；pH为7.71时，E’0= -0.5787V。
辣根过氧化物酶的作用机理可分以下几步：
第一步，形成绿色有活性的酶一底物复合物Ⅰ：
第二步，复合物Ⅰ转变成红色有活性的复合物Ⅱ：
复合物Ⅰ+AH→复合物Ⅱ+A
第三步，复合物Ⅱ被还原，释放出酶：AH：表示还原型氢供体。
在一定程度上复合物Ⅱ可自发地分解成HRP和产物（P），亦可与过量的过氧化氢形成无活性的复合物Ⅲ。
辣根过氧化物酶的活力测定方法有多种，主要原理介绍如下：
1、Rz值，提纯工作的后几步以及纯酶溶液可用Rz值表明酶的纯度。
403nm处的吸收代表血红素辅基的吸收，275nm的吸收是蛋白质的吸收，结晶的HRP的Rz值为3.04。测定时的酶浓度为1毫克蛋白/毫升。
2、愈创木酚法：测k4[见反应式⑶]。以愈创木酚（邻甲氧基酚，guaiacol）为氢给体，其反应如下：
四邻甲氧基连酚有色产物四邻甲氧基连酚（E470nm = 26.6mM－1·cm－1）生成的速度（dx/dt）与底物过氧化氢以及氢供体愈创木酚的浓度有关。方程如下：
e—酶浓度；
α0—氢供体起始浓度；
x0为过氧化氢的起始浓度。
如果测定的条件选择成k4α0＞＞k1x0，可以测得k1：
所以：
—测定过程中底物减少的速度。
△x/△t
本实验是采用测定k4的方法来判断酶的纯度。
上述测定Rz值和k4值的方法虽然比较简单，但都不能测得酶的实际活力单位。测定过氧化物酶的传统方法是连苯三酚试验法，以过氧化氢为底物，在酶作用下，连苯三酚可形成红棓酚（Purpurogallin），在430nm处测定产物的形成。用红棓酚值（PZ）表示酶的活力。PZ表示在标准测定条件下1毫克酶所形成的红棓酚微克数。
