膜蛋白的结构形成过程研究
1）膜蛋白的结构形成过程研究
成孔毒素（Pore-forming toxin, PFT）能在靶细胞膜上寡聚化形成穿膜通道, 破坏细胞膜结构并使其渗透性增强而导致细胞渗透性溶解。 PFT寡聚体在细胞膜上可以连接形成密排六方结构（hcp）。
Lysenin是来源于蚯蚓的一种PFT，可在鞘磷脂/胆固醇（SM/chol）双层膜结构中寡聚化并形成hcp。实验中，研究人员使用了日本RIBM的超高速视频级原子力显微镜（HS-AFM），对SM/chol双层膜结构中lysenin寡聚体组装成hcp的动态过程进行了实时成像，发现了hcp结构形成的规律。
研究人员将lysenin与SM/chol双层膜结构在云母为基底的环境下共同培养后使用HS-AFM进行成像。下图显示了lysenin寡聚体形成的hcp在膜结构上的分布。白色六边形表示一个hcp单元，箭头表示未完全形成的寡聚体。通过计算可以获得Hcp单元的间距和寡聚体直径等数据，与之前使用电镜的研究获得的数据一致。
通过HS-AFM还可以获得lysenin寡聚体的三维图像。对各个寡聚体的高度数据进行统计，可以发现高度分布主要为两种，高度较低的寡聚体已经嵌入了膜结构中，并可能形成了核孔。
接下来研究人员对400×300nm区域内的SM/chol双层膜结构上的lysenin组装过程进行了动态成像。图A展示了lysenin簇的形成并可以检测簇的增长方向（图B），最终组装形成hcp结构。
在黑色的云母基底上也能观察到lysenin，分析双层膜结构上和基底上的lysenin半径大小可以得出，双层膜结构上的lysenin形成了寡聚体进而组成hcp结构，而基底上的lysenin处于单体或不规则聚集形态，无法形成寡聚体，这也与之前的研究结果一致。
对视野内的lysenin簇如B图进行划分并进一步分析可以得出：
1. Lysenin形成单个簇后，在双层膜上水平扩散，聚集排列形成hcp结构；
2. 新形成的簇会组成新的矩形排列（彩色矩形）或填充到已有的矩形排列的空缺处，有些已经形成的簇会在膜上扩散或分解；
3. 矩形排列的方向可变（如最上方红色矩形）；
4. 绝大多数Lysenin簇在装配开始就会聚集形成簇，而不是随机分布在膜上。
HS-AFM还可以在更高的放大倍数下以更高速率成像，以实现对lysenin簇组装成hcp结构的动态进行更详细的检测。
通过对结果的分析可以得出，大部分从外围结合到hcp结构区域的簇会以平均0.45秒的时间分解，而已经形成hcp结构的则相对更加稳定，可能原因是内部的lysenin寡聚体相互之间具有更多的结合位点，更难以分解。
小结：高速AFM成像可用于lysenin形成hcp结构的动态过程的研究。lysenin簇于膜上形成，经过大量的分解\重组和扩散形成hcp结构，随着膜上hcp数量的增多而趋向于稳定。同时，我们还可以获得簇的高度信息，用于表征lysenin与膜的结合以及穿膜通道的形成。
2）膜蛋白的结构形成机制研究
膜联蛋白（Annexin）是于真核细胞的细胞质内普遍存在的一种蛋白，与多种细胞膜功能相关，如胞吞、胞吐以及离子转运等。膜联蛋白在钙离子环境下可结合至磷脂，进行细胞膜修复等作用，但至今对于膜联蛋白-钙离子-磷脂三者的组装与分解的动态过程的研究仍处于空白。
这项研究中，研究人员使用日本RIBM的超高速视频级原子力显微镜（HS-AFM）引导了膜联蛋白V（A5）的组装与分解并进行成像，分析了过程中的蛋白结构，动力学和分子间相互作用。
研究人员首先将双层脂膜加入含2mM钙离子的缓冲液，再加入A5并用HS-AFM成像。可以观察到A5三聚体在膜上形成了六边形晶格结构（标记1），并在中间含有纵向高度更低的三聚体（标记2）或者空洞（标记3），这与先前使用其他AFM和电镜的结果相一致。
