新抗新冠病毒药物潜在作用靶点—新冠病毒包膜蛋白
新冠病毒已经感染超过1.5亿人次，并导致300多万人死亡，然而迄今尚无用于新冠肺炎的特效药物。新靶点的发现和确证对于抗新冠病毒药物研发具有重要意义。
2021年6月10日，中科院上海药物所高召兵、李佳、沈敬山，以及武汉病毒所张磊砢、昆明动物所郑永唐联合研究团队在Cell Research 发表了题为SARS-CoV-2 envelope protein causes acute respiratory distress syndrome (ARDS)-like pathological damage and constitutes an antiviral target 的研究论文，报道了一个新抗新冠病毒药物潜在作用靶点—新冠病毒包膜蛋白（SARS-CoV-2 envelope protein，2-E）通道。该论文首先证明了新冠病毒包膜蛋白可形成一种酸敏感阳离子通道，且实验显示该通道本身可导致细胞死亡、促进炎症因子释放及小鼠ARDS样损伤，进而通过活性筛选与结构优化发现了多个在动物模型上兼有预防和治疗作用的小分子通道抑制剂。值得指出的是，疫情暴发伊始，研究团队即开展联合攻关，并基于其在离子通道和病毒研究方面的积累，很快证明了包膜蛋白形成离子通道并具有成为新型药物作用靶点的潜力，于2020年6月以预印本形式发表了部分工作。
包膜蛋白2-E形成新型阳离子通道
新冠病毒包含刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)共4个结构蛋白。包膜蛋白（E）是其中最小的结构蛋白，长约75个氨基酸，其蛋白本质和生理病理功能尚不明确。其它冠状病毒E蛋白的研究显示该类蛋白具有离子通道活性，但将其作为干预靶点的研究较少报导。
该研究中高召兵研究团队与合作者将纯化的包膜蛋白2-E重组于人工脂质双分子层上，首次获得了由2-E介导的单通道电流，证实其为离子通道；通过改变记录的内外液条件，发现2-E通道为阳离子通道，可以通透单价阳离子钾、钠和二价阳离子钙、镁；采用同时改变内外液pH并结合质子滴定的方法，首次证实随着内外液pH值的降低，2-E通道电导与开放概率逐渐升高，通道活性增强。以上结果表明，SARS-CoV-2-E能够形成pH值敏感的非选择性阳离子通道。值得指出的是，有研究发现新冠病毒可通过酸化溶酶体、改变酶活性从而从胞内释放；在感染新冠病毒的重症患者体内，也存在严重的离子失衡，与包膜蛋白2-E蛋白形成酸敏感离子通道可能具有一定关联性。
包膜蛋白2-E通道诱发宿主细胞死亡与体内炎症风暴
新冠病毒感染患者体内发生细胞因子风暴，出现肺泡损伤、水肿、出血、间质炎性浸润，重症患者会出现急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。在细胞水平，研究团队通过在不同种属来源与不同类别的细胞系中表达2-E通道，发现其通道功能可诱导宿主细胞发生死亡；通过2-E直接表达、2-E蛋白刺激以及巨噬细胞共培养的方式发现2-E通道蛋白可诱发体外炎症分泌。进一步研究显示，2-E蛋白在小鼠体内可诱导TNF-α、IL-6以及趋化因子CXCL9、CCL12的表达水平显著上升，以及肺组织发生ARDS样损伤，与COVID-19患者体内所观察到的现象具有一些相似性。
包膜蛋白2-E通道参与SARS-CoV-2病毒复制
研究团队采用丙氨酸突变扫描技术，发现了两个显性负突变2-EF4A与2-ET11A。与野生型2-E对比，这两个突变通道活性较低；转染细胞后发现，突变组的病毒基因拷贝数显著降低；体内外给予突变通道蛋白，其导致的炎症因子释放和ARDS样损伤亦显著降低。以上结果显示包膜蛋白2-E的通道活性在SARS-CoV-2病毒组装和释放以及引起宿主损伤过程中发挥重要作用。
包膜蛋白2-E通道抑制剂在动物模型上可预防和治疗SARS-CoV-2感染
依托上海药物所离子通道研究平台研究团队开展了通道抑制剂的筛选和发现工作，从数千种老药、天然产物中挑选出BE系列化合物进行深入研究。实验结果表明，BE系列化合物在通道抑制活性、细胞保护作用和抗病毒活性方面有着较好的正相关性，从而支持了BE系列化合物是通过抑制2-E的通道活性来发挥细胞保护以及抗病毒作用的观点。综合考虑体外活性、代谢性质和毒性评价结果，研究团队选择BE-33作为候选化合物，通过预防和治疗给药2种方式考察该化合物的体内抗病毒作用。将BE-33以尾静脉注射的方式给予人血管紧张素转换酶-2（hACE-2）转基因小鼠，分别在感染后的第1天及第3天，解剖小鼠并观察小鼠器官的病理变化，期间采用qRT-PCR的方法检测小鼠体内SARS-CoV-2的复制情况。结果显示，接受BE-33预防给药/治疗给药的小鼠与对照组小鼠相比，其肺部病毒RNA水平在第1天和第3天均有下降的趋势。此外，尸检显示对照组小鼠的下呼吸道出现不同程度的水肿、出血，提示其发生间质性肺炎，而BE-33可以缓解这些症状。同时评估感染小鼠体内炎症，结果发现BE-33组小鼠的炎症细胞因子和趋化因子水平明显低于感染小鼠。上述实验结果说明，BE-33在预防给药组以及治疗给药组均展现了良好的效果，尤其在治疗给药组中展现了优良的抗病毒作用。文献调研结果也显示，这是为数不多的在动物水平预防和治疗性给药均有效的化合物。
综上所述，高召兵/沈敬山/李佳/张磊砢/郑永唐联合研究团队发现并首次证明了新冠病毒包膜蛋白可形成离子通道，阐释了其可能介导的生理和病理功能，并发现了在动物水平兼具预防与治疗SARS-CoV-2感染作用的小分子通道抑制剂。这项工作为抗新冠病毒药物研发提供了潜在新靶点，同时发现了具有潜力的抗新冠病毒新药候选化合物。该项研究工作还提示，以离子通道为靶点开展抗击包括新冠病毒在内的突发病毒感染药物研发具有重要价值。
上海药物所夏冰清副研究员、博士生申许瑞、何洋副研究员，以及武汉病毒所潘晓彦副研究员、昆明动物所刘丰亮副研究员为该论文的共同第一作者。上海药物所高召兵研究员、李佳研究员、沈敬山研究员，以及武汉病毒所张磊砢副研究员、昆明动物所郑永唐研究员为共同通讯作者。研究工作同时得到了上海药物所蒋华良院士、周虎研究员、程曦副研究员以及武汉病毒所肖庚富研究员的支持和帮助。共同作者还包括该联合研究团队其它成员。
