使用实时定量 PCR技术验证cDNA和差异显示PCR技术（一）
采用通过监测产物积累进行的实时反转录聚合酶链式反应（ RT － PCR ）可以用来验证基因表达的差异。我们在此报道了一种基于 SYBR Green I 染料进行的实时 PCR 定量方法并通过产物的融解曲线来确定在基因表达谱方法中确定的基因表达差异的重复性。因为 SYBR Green I 染料是一种非特异性的结合染料，所以反应使用了"热启动" PCR 以及通过经验性数据来确定退火以及检测产物的温度。相对的基因表达水平可以通过使用一系列的 cDNA 浓度做出标准曲线来进行定量。使用这种方法，实时 PCR 可以确定 DNA 阵列 71% （ 17 ／ 21 ）的准确性，和 91% （ 1 ／ 31 ）的差异显示的准确性。验证 DNA 阵列的基因表达差异与杂交信号的强弱有关。实时 RT － PCR 结果表明 DNA 表达差异在 2 － 4 倍间的差异无法判断其正确错误与否。而差异显示 PCR 的结果验证不依赖于信号的强度。无论是何种基因表达谱技术（微阵列， DDPCR ，基因表达系列分析技术还是差异杂交技术），如果已经知道目的基因的序列，那么实时 RT － PCR 方法就可以适用于验证这些差异表达，因为它具有定量功能而且需要的 RNA 量比传统方法要低 1000 倍。
DNA 阵列（微阵列）和差异 RT － PCR 方法是两种可靠的确证基因表达和基因组广泛转录本差异的方法。这些技术确定样本表达差异的重复性和敏感性的可靠性受到几个因素的影响。微阵列的实验结果受到阵列产物、 RNA 提取、探针标记、杂交温度条件和图像分析（ 1 － 4 ）的影响。 DD － PCR 结果受到电泳分辨率、弱和差异引物、条带确证和结合部分的影响。因为这些可靠性上的限制，被确定为差异表达的基因要经过另一种方法的检测。 Northern 杂交或者 RNA 酶保护分析都是有效的但是至少要 5mg 的 RNA 。传统的逆转录聚合酶链式反应（ RT － DDPCR ）要求的 RNA 要少一些，但其终点分析缺乏定量上的精确性（ 6 － 8 ）。实时 RT － PCR 技术方法是当前最新的确定基因表达的方法，在这篇报道中，我们详细描述了使用实时 PCR 技术和其与 DNA 阵列以及 DD － PCR 技术的相互结合，来验证基因表达的正确性。
方法描述 :
基本策略
为了满足验证表达谱研究确定的大量基因，我们研究了实时定量 PCR 系统并使用 SYBR Green I 染料。此外，还用每个基因的一系列已知浓度的模板制作了绝对定量曲线，以相对比较不同的样本。相对定量曲线只需要使用在表达谱研究中确定的一个高表达样本中获得的 cDNA 的一系列稀释度制作完成。
尽管仍然需要设计基因特异性的引物，但不需要设计内在的基因特异性的荧光探针。此外，反应的特异性由产物的 Tm 值确定（ Tm ： DNA 双螺旋一半解链时的温度）。反应的特异性由"热启动" PCR 得到提高，并在低于产物 Tm 值 1 － 2 ℃时获得信息。这样就可以避免由通常来说 Tm 值较低的引物二聚体引起的非特异性信号（ 10 ）。
实时 PCR的反应条件
逆转录反应条件
使用在基因表达谱分析中采用的总 RNA 进行验证实验。采用 SuperScript First Strand Synthesis System 进行 RT-PCR （ Invitrogen, Carlsbad, CA) ）反应来合成 cDNA ，反应体系为 20ul ，里面包含 1 m gDNaseI 处理过的总 RNA ， 20 mM Tris–HCl (pH 8.4) ， 50mMKCl ， 2.5mMMgCl2 ， 10mMdithiothreitol (DTT) ， 0.5 m g oligo(dT)12–18, dNTP （各 0.5mM dATP, dGTP, dCTP, 和 dTTP ） 以及 200 U SuperScript II Reverse Transcriptase 。混合组分时，先混合 RNA 和 oligo(dT) ， 70 ℃保温 10 分钟，再放到冰上并加入剩余的反应组分。反应在 42 ℃孵育 1 小时，然后再 70 ℃加热 15 分钟终止反应。 cDNA 再加入 2 U 的 RNase H (Invitrogen) 37 ℃孵育 20 分钟，再在 70 ℃加热 15 分钟终止反应。此外用一个没有逆转录酶的反应来验证是否有基因组 DNA 的污染（无 RT 对照）。 cDNA 在使用前放置在－ 20 ℃保存。进行实时定量 PCR 前不需要进行 cDNA 的纯化。
确定实时定量 PCR 的反应条件
使用 GENSET OLIGOS, Oligo Version 4, (GENSET Corp., La Jolla, CA) 或者 LASERGENE 的 PRIMERSELECT 软件 (DNASTAR, Inc., Madison, WI) 计算产物的 Tm 值来确定反应的退火温度。摸索退火温度时，每次以计算得到的 Tm 值增加或减少 2 － 3 ℃，直到其与引物二聚体和非特异性产物间有 3 － 5 ℃的差别。信息采集时候的温度可以设置到特异性产物的 Tm 值以下 1 － 2 ℃，以减少非特异性产物的干扰。
反应步骤和循环条件
所有的步骤按照仪器的使用说明进行。按照试剂说明将包含有 Tag DNA 聚合酶， dNTP, MgCl2, 和 SYBR Green I 染料的 DNA Master SYBR Green I 混合液与 0.16 m l TaqStart Antibody (Clontech,Palo Alto, CA) 混合一起室温孵育 5 分钟，然后再加入引物和 cDNA 模板。除此外，每个反应（ 20ul ）中包含 2ul 的 cDNA ， 0.4 m M 的引物和 4 m MMgCl2 。使用 1:200 和 1:2000 稀释的 cDNA ，但分析极微量的信息时要求更少的 cDNA 稀释度。每个稀释度进行一个重复实验，同时用一个无模板的阴性对照，这些优化实验不用于标准曲线。反应条件包括 95 ℃先孵育 60 秒预变性和热启动，然后再进行 50 个循环，过程按优化好的实验结果进行。并最终通过仪器进行一个融解曲线分析。
验证实验
实验条件
通过实验确定退火温度和信号读取温度后，就可以设置样品的相对基因表达反应了。 PCR 的反应条件按上述进行。相对定量曲线用两个重复的预测具有最高表达水平的样品的一系列 cDNA 的稀释度（ 1 ： 200,1 ： 2000 和 1 ： 20000 ）进行。并人为地将其数值定为 0.5 、 0.05 和 0.005 。未知模板的的 cDNA 稀释 200 倍。每个基因都做一个无模板的对照，非 RT-PCR 对照只用一对引物来确定是否有基因组 DNA 的污染。引物为 G3PDH 的引物，并同所有的稀释为 1 ： 200 的无 RT 模板进行比较。
反应温度也同上进行热启动过程并按照反应条件进行，同时也做融解曲线分析。为了使结果可信，至少三个定量稀释度中的二个必须特异性的反应（以 Tm 值为交准），而无模板对照在比信号读取温度低的时候必须没有产物和引物二聚体。如果只有一个稀释度产生了特异性产物，那么则需要重新调整稀释度来保证至少标准曲线上有两个可应用的点，如果引物二聚体影响了读板温度，就应该调整反应温度。如果无 RT 对照通过融解曲线分析发现有产物存在，则应用 DNA 酶 I 来消除 DNA 污染。
计算
每组反应都用随机的软件进行分析，并按照软件的操作手册进行。简单地来说，就要设定好域值线消除掉无信息的荧光背景信号，标准曲线由仪器自动按照设定好的值生成。软件能为每个反应自动计算最终的浓度。并最终得到样本的浓度和相关系数。
使用实时 PCR技术验证基因表达:
当待检基因序列已知时可以用上述描述的定量 RT － PCR 的方法来验证不同基因表达方法（ cDNA 阵列， DD － PCR ，基因表达系列分析以及杂交）得到的结果。这里描述的是用实时定量 PCR 技术来检测与微阵列与 DD － PCR 方法得到的结果。详细的步骤在图 1 中进行了描述。
验证 DNA阵列结果
可用以上述描述的方法来验证任何阵列平台（ cDNA 或寡核苷酸）得到的基因表达差异。例如，我们使用采用基于 cDNA 的高密度阵列（ Atlas Human Cancer cDNA Expression Array; Clon-tech ）来研究 W12 脑上皮细胞的两个亚克隆 (20863 和 20861) 采用 HPV16 处理不同状态时的基因表达差异（ 9 ）。用于验证的基因基于其杂交的荧光强度（亚克隆 20863 作为参考）和相对荧光强度（亚克隆 20863 与亚克隆 20861 ）。
基因特异性引物来验证阵列结果
对于 Clontech 阵列来说，可以从制造商处获得基因特异性引物的信息。在本例中，需要的只是合成引物。如果没有此信息，可以设计基因特异性的引物（使用从 GenBank 中得到的序列信息）以用于验证结果。引物应当为 17–24 个碱基长，产物大小为 150–650bp 。产物太大的话不适用用于定量扩增。避免基因家族的保守性区域可以得到更好的特异性结果。
