毛细管电泳-电致化学发光法测定化妆品中氨甲环酸含量
将氨甲环酸进行N-甲基化衍生反应后，其衍生产物能与联吡啶钌电致化学发光试剂产生强的共发光信号，据此建立了毛细管电泳-电致化学发光法高选择性测定日用化妆品试样中氨甲环酸含量的新方法。实验中发现，添加一种Mg2+-海藻糖-SiO32-三元缔合物凝胶至背景电解液中，可极大地改善电泳分离效能。在优化的分析条件下，氨甲环酸和内标物肌氨酸衍生产物的电泳峰可在500 s内达到完全分离，且此两个电泳峰的强度比值与氨甲环酸的初始浓度在10~750 μmol/L的范围内呈良好的线性关系（相关系数r2=0.9993），检出限为3.6 μmol/L（S/N=3）。采用内标法对3种市售牙膏膏体和2种面膜护理液中的氨甲环酸进行了定量测定，测得这些试样中氨甲环酸含量的均值分别为4.05、0.24、6.06 mg/g和51.3、7.98 mg/mL，加标回收率在92.5%~104.0%内，结果令人满意。
氨甲环酸(反式-4-氨甲基环己烷甲酸, TA), 又名凝血酸、传明酸, 是一种具有止血作用的化学合成药物, 已被广泛应用于内科、外科及口腔科等临床医学领域, 作为一种治疗牙龈出血症的有效药物成分也常被添加在牙膏配方中。此外, 人们还发现, 氨甲环酸具有抑制黑色素斑形成、去除皮肤皱纹等美容效果, 它也作为一种皮肤护理剂广泛添加在化妆品中。然而, 长期使用含有此类药物的日化品很可能升高人体内形成血栓的风险并导致其他一些不良作用。日化品中氨甲环酸的准确分析方法能对其过量添加行为进行更加严格的监管, 也为保障此类日化品的长期安全使用提供数据信息。
目前, 可用于检测氨甲环酸含量的主要方法有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、紫外检测毛细管电泳法、微芯片分离-化学发光联用法、荧光法和分光光度法等。其中针对生物、化妆品之类具有复杂基底成分的试样, 通常都会采用液相色谱法来进行常规分析。由于氨甲环酸分子在紫外-可见光区的光吸收性能较弱且没有分子荧光特性, 为提高液相色谱光检测器的检测灵敏度, 氨甲环酸需先进行化学衍生反应后再进样分析； 而为消除过量衍生试剂和衍生副反应产物的基底干扰引入的分散液/液微萃取操作环节, 也必然导致样品分析的前处理过程变得比较繁琐、复杂。毛细管电泳-电致化学发光(CE-ECL)联用法是一种高分离效率、高选择性、高灵敏度、低成本的分析新技术, 业已用于临床医学、环境、食品等不同领域的实际样品检测。基于我们此前报道的方法, 本文采用甲醛为N-甲基化衍生试剂, 可将氨甲环酸转化为具有强发光信号的衍生产物, 用CE-ECL法实现了对复杂基底样品中氨甲环酸的分离、检测。
在毛细管电泳分离的过程中, 待测样中各物质的分离既受背景电解液中添加物质的影响, 又与毛细管内壁给予的作用力大小密切相关。例如, 用内壁修饰的毛细管做分离柱时, 含蛋白质成分的样品中某些组分间的分离度会增大, 总分析时间变短, 重现性更好。近年来, 一些无机纳米粒子复合材料也逐渐用于修饰毛细管内壁, 以降低样品基底物质在毛细管柱上的记忆效应, 改善电泳分离效率。因此, 我们在现有壳聚糖修饰毛细管内壁的技术基础上, 又将磷灰石纳米粒子掺杂于壳聚糖中, 制备了壳聚糖/磷灰石纳米粒子涂层修饰的毛细管分析柱, 从而极大地提高了对含氨甲环酸试样的分离效率和分析结果的重现性。此外, 背景电解质中分离添加剂的作用也是影响电泳分离效率的主要因素, 环糊精、离子液体和表面活性剂都是常见的分离添加剂成分。本文首次发现一种经化学合成反应形成的Mg2+-海藻糖-SiO32-三元缔合物凝胶(MTS-gel), 可以作为分离添加剂使用。将它与三聚磷酸钠、十二烷基苯磺酸钠和1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体共同加入配制的背景电解质溶液时, 分离效果很好, 据此建立了高选择性检测日化品中氨甲环酸含量的CE-ECL新方法。
01
电泳测定条件
经试验优化后的背景电解质溶液组成为: 2.5 mmol/L硼砂(pH=8.75)+ 4.4 mmol/L三聚磷酸钠(STPP)+ 8.0 mmol/L十二烷基苯磺酸钠(SDBS)+ 0.35% (v/v)离子液体(ImidBF4 IL)+ 0.14 mmol/L MTS-gel(按Mg2+计量)； 检测池中液体组成为: 4.0 mmol/L Ru(bpy)32+ + 125 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.0)；电动进样高压为11.5 kV, 进样时间为10 s； 毛细管分离高压为13.5 kV； 光电倍增管负高压为865 V。每天实验前先用含4.4 mmol/L的STPP + 8.0 mmol/L SDBS + 2.5 mmol/L硼砂缓冲溶液(pH=8.75)的运行缓冲液冲洗600 s； 每连续实验4 h之后须更新含Ru(bpy)32+的检测池内溶液, 以保证分析实验的重现性。所有进入毛细管内的液体均须经0.45 μm醋酸纤维素膜过滤后再使用。
MTS-gel的合成方法:在一只10 mL的比色管中加入10.0 mmol/L的硝酸镁1.00 mL、20.0 mmol/L的海藻糖溶液0.50 mL、20.0 mmol/L的硅酸钠溶液3.00 mL后用水定容, 并置于32 ℃的水浴锅中保温反应13 min, 取出后自然冷却至室温备用。此凝胶须用前临时制备, 当它作为分离添加剂配制运行液时, MTS-gel凝胶就能转化为比较稳定的溶胶形式, 因此配制好的运行缓冲液保存于冰箱中就可保证正常使用数天。
石英毛细管采用了壳聚糖/磷灰石纳米粒子做修饰内壁, 具体修饰步骤参见原文中文献[27], 所有制备环节中仅将含10.0 mg/mL的壳聚糖稀冰醋酸溶液(1.0%, v/v)置换为含10.0 mg/mL壳聚糖+1.0 mg/mL纳米羟基磷灰石的稀冰醋酸溶液(1.0%, v/v), 而保持其他制备条件完全一致, 即可制备出符合分析要求的内壁涂饰毛细管。
02
标准溶液和试样溶液的配制与衍生反应步骤
用标准品试剂分别配制1.00 mmol/L氨甲环酸溶液和1.00 mmol/L肌氨酸溶液储备液, 置于4 ℃冰箱中保存备用。使用前按所需浓度准确吸取、用水稀释后配制成标准工作液。
称取1.000 g牙膏膏体样品于50 mL小烧杯中, 先加入0.5 mL 10 mol/L的硝酸钙, 搅拌并静置5 min后再加入0.5 mL 10 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH=7.0), 再搅拌后加入2.0 mL无水乙醇, 搅拌均匀后全部转移至25 mL比色管中, 以水定容, 放置达到自然沉降分层, 定量吸取上层清液备用。
面膜营养液样品可采用机械挤压法, 直接提取适量体积的试样原液至100 mL小烧杯中, 可不加硝酸钙和磷酸盐缓冲液, 仅加2.0 mL无水乙醇和适量水搅拌, 再全部转移至25 mL比色管中以水定容, 备用。所有预处理后的待测溶液应先加适量内标物, 并按适当倍数稀释定容, 之后可用于下一步的衍生反应。
在一只10 mL比色管中先加入1.00 mL 0.25 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH=5.95), 用移液管准确加入一定体积的混合标准溶液(含内标物)或待测样溶液(此刻加入溶液的总体积小于3.0 mL), 再加入1.00 mL 0.5 mol/L的甲醛溶液, 并用水稀释到5.0 mL刻度处, 于室温下放置60 min； 然后, 在比色管中依次加入0.40 mL 0.20 mol/L的氢氧化钠和0.60 mL 0.01 mol/L的顺丁烯二酸溶液, 摇匀后放入57 ℃恒温水浴中加热反应50 min, 取出冷却至室温； 再逐次加入0.25 mL 0.1 mol/L醋酸铵、1.0 mL 0.25 mol/L硼氢化钠(使用时现配)以及0.50 mL 0.2 mol/L的硼酸溶液, 3种试剂的加入间隔时间分别为10、20和10 min。最后, 以水定容至10.0 mL刻度处, 取此溶液经由滤膜过滤后进样测定, 也可于冰箱中保存, 2周内测定。
