免疫组化基础知识-2
*组织冻结过程中，细胞内、外的水分会形成冰晶，冻结的速度愈慢，冰晶颗粒愈大，可严重影响组织、细胞的形态结构。因此制备冻块时要求低温、速冻。
1、冰冻组织块的常用方法
*液氮中冰冻：组织投入液氮中 (一196C)中10～20sec；
*干冰中加入丙酮(或异戊烷)，液体立即气化起泡，温度降至一70C ，将组织投入，若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容器，组织投入该容器内结冻则更好；
-上述组织在速冻时应浸埋于OCT包埋剂或甲基纤维素糊状液内，以保护组织。
-制成冻块后若需保存，应以铝箔或塑料薄膜封包，贮存于-70 C冰箱。
2、切片
*供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整，并有连续性。
*载玻片也应清洁无油污，但一般无需涂抹粘附剂；
*切片时，使用恒温冷冻切片机，在箱内温度-25 C 。切片厚度一般为4～8m。
3、切片后处理
*切好的冰冻切片，室温下自然晾干1～2h后，入4C丙酮固定10min，待干燥后作免疫组化染色或封存于-20℃。
*冰冻切片由于切片技术要求较高，不易得到连续性很好的切片，其形态结构亦不如石蜡片，且冻块和切片不便于长期贮存，因此冰冻切片的应用受限。
(三) 组织印片
*将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面，细胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min，自然干燥后染片或-20℃保存。
(四) 细胞培养片(细胞爬片)
*贴壁细胞培养时，置盖片于培养瓶中，使细胞在盖片上生长，达适当密度后取出固定(丙酮-20C固定10～20min)，再进行免疫染色。
-盖片的处理方法同载玻片的处理，但泡酸时间2h即可。
-为了防止细胞脱片，可用多聚赖氨酸处理。
(五) 细胞涂片
*大多数细胞涂片由细胞悬液制成，包括：
-血液、尿液、脑脊液；
-体腔积液；
-组织穿刺吸取，如骨髓、淋巴结或其他实质性组织
-悬浮培养的细胞或贴壁细胞经消化后形成的悬液。
(五) 细胞涂片 (续)
*细胞涂片的方法：
-手涂法
*将细胞浓度调节到106/ml左右，可直接涂于载玻片上，但要均匀、不重叠。
*图片范围应小于1cm直径，以节约试剂。
-涂片机涂片法
*将细胞样品制成2×105～6/ml 细胞悬液，吸取50～100l (1～2×104～5cells) 加入涂片机内，1000rpm离心2min后细胞就均匀分布于玻片上。
三、免疫组化常用的染色方法
*根据标记物的不同分为
-(一) 免疫荧光法
-(二) 免疫酶标法
-(三) 亲和组织化学法
(一) 免疫荧光法
【原理】
*用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素，可标记抗体或抗原；
*荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光，籍此可作定位观察或示踪；
*借助于荧光显微镜进行观察。
1、常用的荧光素
*(1) 异硫氰酸荧光素 (Fluorescein Isothiocyanate, FITC)
*(2) 四甲基异硫氰酸罗丹明 (Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate, TRITC)
*(3) 四乙基罗丹明 (RB200)
*(4) 碘化丙啶 (propidium iodide, PI)
(1) 异硫氰酸荧光素(FITC)
*易溶于水和乙醇。
*最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为 520～530nm．呈翠绿色荧光，分子量 389.4。
*在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键，成为标记的荧光抗体。一个lgG分子上最多能标记15～20个FITC分子。
(2) 四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)
*最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈红色荧光，分子量为444。
*与蛋白质结合的方式同FITC。
(3) 四乙基罗丹明(RB200)
*不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。
*最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为595～600nm，呈橙红色荧光，分子量为580。
*RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯(SO2Cl)，在碱性条件下，易与蛋白质的赖氨酸-氨基反应而标记在蛋白分子上。
(4) 碘化丙啶(PI)
*是常用的DNA荧光标记探针，可作为FITC的胞核对比染色。
*PI可嵌入到双链DNA和RNA碱基对中并与之结合，但对碱基无特异性选择。
*最大吸收光谱是493nm，最大发射光谱是630nm，呈红色荧光。
2、荧光抗体的保存
