分子生物学课程教学讲义（四）
第四讲 DNA、RNA和蛋白质代谢
DNA是贮藏遗传信息的最重要的生物大分子。DNA分子中的核苷酸排列顺序不但决定了胞内所有RNA及蛋白质的基本结构，还通过蛋白质（酶）的功能间接控制了细胞内全部有效成份的生产、运转和功能发挥。贮藏在任何基因中的生物信息都必须首先被转录生成RNA，才能够得到表达。DNA和RNA虽然很相似，只有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同，但它们的生物学活性却很不同。
RNA主要以单链形式存在于生物体内，其高级结构很复杂；RNA既担负着贮藏及转移遗传信息的功能，又能作为核酶直接在细胞内发挥代谢功能。
蛋白质是生物信息通路上的终产物，一个活细胞在任何发育阶段都需要数千种不同的蛋白质。因此，活细胞内时刻进行着各种蛋白质的合成、修饰、运转和降解反应。
一、核苷酸的合成与代谢
核苷酸是DNA和RNA的前体是细胞内化学能流通领域中的载体（ATP， GTP）,是NAD、FAD、S-adenosylmethionine及 Coenzyme A等的重要成份。在糖代谢中也有重要作用，如生成UDPG和 CDP-diacylglycerol等。cAMP, cGMP还是第二信使。
1、De Novo嘌呤核苷酸的生物合成始于PRPP （Phosphoribosyl 1-pyrophosphate）
这一途径的第一步是由谷氨酰胺捐献一个氨基到PRPP的C-1位上，生成5-phosphoribosylamine。
其次，把甘氨酸中的三个基团加到PRA上。
第三，由N10-甲基四氢叶酸提供一个甲基。
第四，谷氨酰胺提供另一个N。
第五，脱水环化形成咪唑环。
第六，羧基化
第七，通过分子重排将羧基从咪唑第4碳的环外氨基上转移到第5位碳原子上。
第八-九，由天门冬酰胺把另一个氨基加到第5位碳原子上。
第十，再由N10-甲基四氢叶酸提供一个甲基。
第十一，脱水环化，形成嘌呤IMP。
参与合成AMP的是①腺苷琥珀酸合成酶和②腺苷琥珀酸裂解酶。
参与合成GMP的是③IMP脱氢酶和④XMP-谷氨酰胺酰胺转移酶 。
2. 嘌呤核苷酸合成中的反馈调节
3．嘧啶核苷酸是由天门冬酰胺、 PRPP和氨基甲酰磷酸等共同形成的
嘧啶从头合成途径不同于嘌呤的合成，6-原子嘧啶环首先被合成，然后才与核糖-5-磷酸相连。这个反应需要氨基甲酰磷酸（Carbamoyl phosphate）。
4．核苷单磷酸转化为核苷三磷酸
反应生成的ADP可通过糖酵解酶或氧化磷酸化途径被进一步磷酸化。
ATP能够把磷酸基团加到其它所有核苷单磷酸上生成核苷三磷酸。
核苷二磷酸可通过一个公用的核苷二磷酸激酶被进一步磷酸化生成核苷三磷酸。
5．核糖核苷酸（ribonucleotides）是脱氧核糖核苷酸（Deoxyribonucleotides）的前体。所有 dNTP都直接来自于NTP（其实是NDP）。这个反应很特殊，因为核糖上的还原反应发生于一个没有活化的碳原子上。催化该反应的酶是核糖核苷酸还原酶。
大肠杆菌核苷酸还原酶有两大特征，它的生物学活性和底物特异性同时受效应子（effector molecules）的影响。每个R1亚基上都有两个调节位点，当影响整体酶活性的那个位点与ATP相结合时，酶活性增加；而当它与dATP结合时，酶活性消失。
第二个调节位点控制了底物特异性。当dATP与该位点相结合时，UDP和CDP的还原反应优先进行。当dTTP与该位点相结合时，GDP的还原反应优先进行。
核糖核苷酸还原反应的主要过程
1. 还原酶R2亚基处于氧化态-X˙，向核糖3'位碳原子上的H发起攻击，生成3'位自由基。
2. R1亚基上的-SH基团为2'-OH提供一个H原子，使之生成-OH2基团。
3. 脱水后，3'位自由基帮助维持2'位O+基团。
4. R1亚基上的另一个-SH基团为2'-CH+提供一个H原子
5. 2'上的C˙-OH向R2亚基上的X-H发起攻击。
6.
2'上的C-OH失去氧原子，生成dNDP。其中，dTMP（thymidylate）来自于dCDP和dUMP，其直接前体是dUMP，由胸苷酸合酶（thymidylate
synthase）将dUMP转化为dTMP；反应中的甲基来自于N5，N10-Methylene-tetrahydrofolate。
7、嘌呤和嘧啶降解后分别生成Uric Acid和Urea。
嘌呤核苷酸降解
第一步是在5'-核苷酸酶（5'-nucleotidase）的作用下消去磷酸基团，由Adenosine-monophosphate变成Adenosine，或从GMP变成Guanosine。
二、在Adenosine deaminase的作用下生成Inosine；
三、在nucleosidase的作用下生成Hypoxanthine或由Guanosine生成Guanine；
四、在Xanthine oxidase或Guanine deaminase作用下生成Xanthine；
五、在Xanthine oxidase的作用下生成Uric acid。
嘌呤代谢突变会引起重要疾病。
如人体内缺失adenosine
deaminase，会引发严重的免疫缺失性疾病，因为此时T-淋巴和B-淋巴细胞不能正常发育。AD缺失后，细胞内dATP的含量将高达正常细胞中的100倍，而过量的dATP则抑制了其余dNTP在T-淋巴细胞中的合成。许多化疗（chemotherapy）药剂都针对核苷酸合成途径。如Azaserine和Acivicin都是Glutamine类似物，被用于阻断核苷酸的生物合成。
胸苷合成中的主要抑制剂有fluorouracil（氟脲）、methotrexate（氨甲基叶酸）和aminopterin（氨喋呤）。氟脲本身不是thymidylate synthase 抑制剂，但它在细胞中被转化为FdUMP以后，就能直接与TS相结合并使之失活。氨甲基叶酸和氨喋呤都是dihydrofolate reductase的抑制剂，氨甲基叶酸与该酶的亲和力比底物dihydrofolate高100倍。
二、氨基酸代谢
按所占的质量比例计算，N在生物体内的重要性排在CHO之后，列第4位。大量N元素都是有机氮，被结合于氨基酸或核苷酸分子中。
地球上的动植物共含氮约1.5×1010t，而每年通过硝化细菌以气态氮的形式释放到大气中的氮就有2×108—5×108t。全世界氮肥厂每年生产的化肥仅含氮约108t，所以，如果没有生物固氮，生命很快就不复存在了。
1. 铵通过谷氨酸→谷氨酰胺被结合到有机物质中。
主要有两步反应：
⑴Glutamate+ATP→γ-glutamylphosphate+ADP
⑵γ-Glutamyl phosphate+NH4+→glutamine+Pi+H+
总结：
Glutamyl+NH4++ATP→glutamine+ ADP+Pi+H+
因此，谷氨酰胺合成酶是氮代谢中的主要调控位点。
在大肠杆菌中，GS由12个相同的亚基（50kDa）聚合而成，其活性既通过构象变化，也能通过共价修饰的方式得到调节。Alanine，Glycine和其它至少6种gln代谢产物都是GS活性的变构抑制剂，每个抑制剂都只有部分抑制作用。除变构抑制之外，GS活性还受共价修饰调节。当第397位酪氨酸被腺苷化后（加上AMP），该酶更容易受变构抑制剂的反馈调节。
2.氨基酸的生物合成
高等动物不能合成大约一半氨基酸，只能从食物中直接获取这些必需氨基酸（Essential）。
表18-1 人体必需氨基酸(*.哺乳期至幼儿期必需)
表22-1 氨基酸合成的六条主要途径
3.氨基酸脱羧基化后生成有机胺。许多重要的神经递质都是胺或其次生代谢产物。Tyrosine降解产物有dopamine（多巴胺），epinephrine（肾上腺素），norepinephrine，统称为Catecholamines（儿茶酚胺）。
4.精氨酸降解产生NO˙(Nitric Oxide)。
本世纪80年代，科学家发现NO是人体内重要的信号分子，它参与神经传递、凝血和血压调控等一系列生理反应。虽然它是气体，极易扩散，但由于它十分活跃，其扩散半径一般只有1mm。
三、氨基酸及功能蛋白质合成后的修饰
1.蛋白质刚刚被合成时，都以fMet（原核）或Met（真核）开始，多肽合成后，N端的formyl group、Met残基，有时还包括N揣多个残基或C端的残基都会被切除。50%的真核蛋白中，N-端残基的氨基酸会被N-乙基化。
2.切除信号肽。许多蛋白质都带有15-30个残基的signal peptides，负责指导蛋白质在细胞中的精确定位。
3.特定氨基酸的修饰。
4.氨基酸的糖苷化
5.氨基酸的异戊烯化（Addition of Isoprenyl Groups）
6.有些蛋白质还要与辅基(prosthetic groups)相结合；
Cytochrome C只有与血红素（heme）相结合才有功能。此外，Acetyl-CoA羧化酶常与Biotin分子相结合。有些蛋白质必须经蛋白酶切割后才有功能。有些蛋白质只有在形成二硫键之后才有功能。
四、蛋白质的运输和降解
1、绝大部分被运入ER内腔的蛋白质都带有一个Signal
peptide。该序列常常位于蛋白质的氨基末端，长度一般在13-36个残基之间，有三个特点： （1）一般带有10-15个疏水氨基酸；
（2）常常在靠近该序列N-端疏水氨基酸区上游带有1个或数个带正电荷的氨基酸；
（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链（Ala或Gly）。
研究发现，信号肽把Ribosome牵引到ER上。蛋白质合成之初，一旦信号肽序列的N端暴露在核糖体外，该序列（包括核糖体）就迅速与SRP（signal
recognition particle）相结合，诱发SRP与GTP相结合，停止新生肽的进一步延伸（此时新生肽一般长约70个残基左右）。
受位于ER外膜上的SRP-receptor及ribosome-receptor的牵引，这个复合物（GTP-SRP-ribosome-mRNA-新生肽）立即向ER外膜靠拢，并通过peptide transport complex进入ER内腔。
5.Rough ER上的蛋白质常常通过运转载体将经过修饰的蛋白质送入高尔基体，再分别送到各个亚细胞位点。
6.蛋白质中的核定位序列一般不被切除。
蛋白质的核定位是通过多个蛋白的共同作用来实现的。Importin (α,β亚基)的作用有点像SRP受体。NLS蛋白-Importin复合物停留在核孔上，并在Ran-GTPase的作用下通过核孔。
细菌细胞内也存在类似的蛋白质运转系统。
7、蛋白质降解是一个有序的过程。
在大肠杆菌中，许多蛋白质的降解是通过一个依赖于ATP的蛋白酶（称为Lon）来实现的。当细胞中存在有错误或半衰期很短的蛋白质时，该蛋白酶就被激活。每切除一个肽键要消耗两分子ATP。
在真核生物中，蛋白质的降解需要Ubiquitin，一个有76个氨基酸残基组成极为保守的蛋白参与。与Ubiquitin相连的蛋白将被送到一个依赖于ATP的蛋白质降解系统（Proteasome，Mr. 1×106）。
成熟多肽N-端第一个残基对蛋白质的稳定性有重要影响 。
五、DNA代谢
无论是只含有一对染色体的原核细胞还是带有多对染色体的真核细胞，只有整个基因组得到了完整准确的复制，细胞分裂才能顺利发生。所以说，DNA复制的起始，标志了细胞进入一个新的周期。
㈠、DNA复制
根据反应阶段和所需的不同酶类，DNA的复制可被分为三个阶段，即复制起始、延伸和终止。每个DNA复制的独立单元被称为复制子（replicon），主要包括复制起始位点（Origine
of replication）和终止位点（terminus）。原核生物的整个染色体上一般只有一个复制起始位点。
大肠杆菌DNA的复制需要有20种左右的酶和蛋白质因子参与，整个DNA复制机器被称之为DNA replicase system或replisome。
Helicase，任何DNA在被复制前都必须解开双链，这个过程是由helicase来完成的，它可在ATP的作用下将DNA母链不断解开形成单链。
Topoisomerase，主要功能是消除DNA解链过程中所产生的扭曲力。
DNA结合蛋白，使新解链的DNA保持稳定结构。
Primases，为DNA复制提供RNA引物。
DNA polymerases，合成新生DNA链，切除RNA引物。
DNA Ligases，使新生DNA链上的缺口（3'-OH, 5'-p）生成磷酸二酯键。
