盘点：分子诊断常用技术（二）
( 五 ) 生物芯片
1991年Affymetrix公司的Fordor利用其所研发的光蚀刻技术制备了首个以玻片为载体的微阵列，标志着生物芯片正式成为可实际应用的分子生物学技术。时至今日，芯片技术已经得到了长足的发展，如果按结构对其进行分类，基本可分为基于微阵列( microarray) 的杂交芯片与基于微流控( microfluidic) 的反应芯片2 种。
1.微阵列芯片
( 1 ) 固相芯片: 微阵列基因组DNA 分析( microarray-based genomic DNAprofiling，MGDP) 芯片: 将微阵列技术应用于MGDP 检测中已有超过十年的历史，其技术平台主要分为2 类，即微阵列比较基因组杂交( array-based comparative genomehybridization，aCGH) 和基因型杂交阵列( SNP array) 。顾名思义，aCGH 芯片使用待测DNA 与参比DNA的双色比对来显示两者间的拷贝数变异( CNV) 的变化，而单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism，SNP) 芯片则无需与参比DNA 进行比较，直接通过杂交信号强度显示待测DNA 中的SNP 信息。随着技术的不断进步，目前市场上已出现可同时检测SNP 与CNV的高分辨率混合基因阵列芯片。MGDP 芯片主要应用于发育迟缓、先天性异常畸形等儿童遗传病的辅助诊断及产前筛查。经验证，使用MGDP 芯片进行染色体不平衡检测与FISH 的诊断符合率可达100%，表达谱芯片( gene expression profiling array，GEP array) : 1999 年，Duggan 等首次使用cDNA 芯片绘制了mRNA 表达谱信息。随着表观遗传学在疾病发生发展中的作用日益得到重视，目前也已出现microRNA 芯片、长链非编码RNA( long noncoding RNA，lncRNA) 芯片等。类似于MGDP 芯片，GEP 芯片使用反转录后生成的cDNA 文库与固定于芯片载体上的核酸探针进行杂交，从而检测杂交荧光信号的强度判断基因的表达情况。相较于基因组杂交，GEP 芯片对生物学意义更为重要的转录组信息进行检测，对疾病的诊断与预后判断具有特殊的意义。目前使用GEP 芯片对急性髓细胞白血病、骨髓增生异常综合征等血液病及神经退行性变等进行诊断、分类及预后评估已经获得了令人满意的效果;
( 2 ) 液相芯片:传统固相芯片将检测探针锚定于固相载体上捕获目的序列，而Luminex 公司的xMAP 技术则通过搭配不同比例的2 种红色荧光染料，将聚苯乙烯微球标记为不同的荧光色，并对其进行编码得到具有上百种荧光编号的微球。通过xTAG 技术将不同的特异性杂交探针交联至编码微球上，使得不同的探针能够通过微球编码得以区分。利用混合后的探针-微球复合物与待测样本进行杂交，使微球在流动鞘液的带动下通过红绿双色流式细胞仪，其中红色激光检测微球编码，绿色荧光检测经杂交后核酸探针上荧光报告基团的信号强度，一次完成对单个样本中多种靶序列的同时鉴定。目前，该技术已在囊性纤维化等遗传性疾病诊断、多种呼吸道病毒鉴定及人乳头瘤病毒分型取得了广泛的应用。
2.微流控芯片
1992 年Harrison 等首次提出了将毛细管电泳与进样设备整合到固相玻璃载体上构建“微全分析系统”的构想，通过分析设备的微型化与集成化，完成传统分析实验室向芯片上实验室( lab-on-chip) 的转变。微流控芯片( microfluidic chip) 由微米级流体的管道、反应器等元件构成，与宏观尺寸的分析装置相比，其结构极大地增加了流体环境的面积/体积比，以最大限度利用液体与物体表面有关的包括层流效应、毛细效应、快速热传导和扩散效应在内的特殊性能，从而在1 张芯片上完成样品进样、预处理、分子生物学反应、检测等系列实验过程。
目前使用微流控芯片进行指导用药的多基因位点平行检测是主要临床应用领域。
二、核酸序列测定
测序反应是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段，是分子诊断技术的一项重要分支。虽然分子杂交、分子构象变异或定量PCR 技术在近几年已得到了长足的发展，但其对于核酸的鉴定都仅仅停留在间接推断的假设上，因此对基于特定基因序列检测的分子诊断，核酸测序仍是技术上的金标准。
( 一 ) 第1代测序
1975年Sanger与Coulson 发表了使用加减法进行DNA序列测定的方法，随后Maxam在1977年提出了化学修饰降解法的模型，为核酸测序时代的来临拉开了序幕。
Sanger 等于同年提出的末端终止法( Sanger测序法) 利用2'与3'不含羟基的双脱氧核苷三磷酸( ddNTP) 进行测序引物延伸反应，ddNTP在DNA 合成反应中不能形成磷酸二酯键，DNA合成反应便会终止。如果分别在4 个独立的DNA 合成反应体系中加入经核素标记的特定ddNTP，则可在合成反应后对产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳( polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE) 及放射自显影，根据电泳条带确定待测分子的核苷酸序列。Appied Biosystems 公司在Sanger法的基础上，于1986 年推出了首台商业化DNA 测序仪PRISM 370A，并以荧光信号接收和计算机信号分析代替了核素标记和放射自显影检测体系。该公司于1995 年推出的首台毛细管电泳测序仪PRISM 310 更是使测序的通量大大提高。Sanger 测序是最为经典的一代测序技术，仍是目前获取核酸序列最为常用的方法。
( 二 ) 第2代测序
1．焦磷酸测序(Pyro-sequencing)
不同于Sanger 测序法所使用的合成后测序理念，Ronaghi分别于1996 年与1998 年提出了在固相与液相载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。其基本原理是利用引物链延伸时所释放的焦磷酸基团激发荧光，通过峰值高低判断与其相匹配的碱基数量。由于使用了实时荧光监测的概念，焦磷酸测序实现了对特定位点碱基负荷比例的定量，因此在SNP 位点检测、等位基因( 突变)频率测定、细菌和病毒分型检测方面应用广泛。由于荧光报告原理不同，其对于序列变异的检测灵敏度从Sanger 测序的20%提高到了5%。但由于该技术的仪器采购与单次检测成本较高，目前尚未得到大规模的临床使用。
2．高通量第2代测序
目前常见的高通量第二代测序平台主要有Roche 454、Illumina Solexa、ABI SOLiD 和Life Ion Torrent 等，其均为通过DNA 片段化构建DNA 文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应，使得第1 代测序中最高基于96 孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应，完成对海量数据的高通量检测。该技术可以对基因组、转录组等进行真正的组学检测，在指导疾病分子靶向治疗、绘制药物基因组图谱指导个体化用药、感染性疾病的病原微生物宏基因组鉴定及通过母体中胎儿DNA 信息进行产前诊断等方面已经取得了喜人的成绩。然而，由于该技术需要对DNA 进行片段化处理，测序反应读长较短( 如Solexa 与SOLiD系统单次读长仅50bp) ，需要对数据进行大规模拼接，因此对分子诊断工作者掌握生物信息学知识提出了更高要求，以利于后期的测序数据分析。
( 三 ) 第3代测序
第3 代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序。该技术的操作平台目前主要有Helicos 公司的Heliscope、Pacific Biosciences 公司的SMRT 和Oxford Nanopore Technologies 公司的纳米孔技术等。该技术进一步降低了成本，可对混杂的基因物质进行单分子检测，故对SNP、CNV 的鉴定更具功效。但是目前其进入产品商业化，并最终投入临床应用仍有很长的距离。
三、基于分子构象的分子诊断技术
( 一 ) 变性梯度凝胶电泳( denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE )与单链构象多态性( single strand conformationpolymorphism，SSCP)
1970 ～1980 年间，Fischer 等与Orita 等分别提出了利用核酸序列变异所导致双链变性条件差异与单链空间折叠差异，通过变性与非变性PAGE 对变异序列进行分离鉴定的方法，即DGGE与SSCP。上述2 项技术均通过变异核酸分子在空间构象上的差异，通过特定条件下电泳速率的变化进行检测。正因为核酸分子构象具有序列特异性，且对于序列的改变非常敏感，常常1 个碱基的变化也能得到鉴定。但由于DGGE 与SSCP 均必须进行PCR 后开盖电泳的操作，现已不常见于临床检测。
(二) 变性高效液相色谱 (denaturing high-performance liquid chromatography，dHPLC)
1997 年，Oefner 和Underhill 建立了利用异源双链变性分离变异序列、使用色谱洗脱鉴定的技术，称为dHPLC，可自动检测单碱基置换及小片段核苷酸的插入或缺失。对于存在一定比例变异序列的核酸双链混合物，其经过变性和复性过程后，体系内将出现2 种双链: 一种为同源双链，由野生正义链-野生反义链或变异正义链-变异反义链构成的核酸双链; 另一种为异源双链，即双链中1 条单链为野生型，而另1 条为变异型。由于存在部分碱基错配的异源双链DNA 与同源双链DNA 的解链特征不同，在相同的部分变性条件下，异源双链因存在错配区而更易变性，被色谱柱保留的时间短于同源双链，故先被洗脱下来，从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。由于该技术使用了较高分析灵敏度的色谱技术进行检测，可快速检出＜ 5%负荷的变异序列。但需注意的是，由于该技术主要通过异源双链进行序列变异检测，其不能明显区分野生型与变异型的纯合子。
（三）高分辨率熔解分析( high-resolution melting analysis，HRMA)
2003年，Wittwer 等首次革命性地使用过饱和荧光染料将PCR 产物全长进行荧光被动标记，再通过简单的产物熔解分析对单个碱基变化进行鉴定。该技术的原理也是通过异源双链进行序列变异鉴定。待测样本经PCR 扩增后，若存在序列变异杂合子，则形成异源双链，其熔解温度大大下降。此时由于双链被饱和染料完全填充，其产物熔解温度的变化便可通过熔解曲线的差异得以判定。对于变异纯合子而言，HRMA 也可利用其较高的分辨率完成PCR 产物单个位点A: T 双键配对与G: C 三建配对热稳定性差异的鉴定，但是对于Ⅱ、Ⅲ类SNP 的纯合子变异则无法有效区分。
如何利用DNA 构象对序列进行推测，从而避免成本较高的序列测定或操作繁琐的杂交反应一直是分子生物学研究与应用的热点问题。目前，使用构象变化对序列变异进行间接检测的便捷性已得到一致肯定，尤其是HRMA 可完成对变异序列单次闭管的扩增检测反应。但需要注意的是，由于基于构象变化的分子检测手段多无法通过探针杂交或核酸序列测定对检测的特异性进行严格的保证，因此其只适合大规模的初筛，而真正的确诊仍需要进行杂交或测序的验证。
四、定量PCR( quantitative PCR，qPCR)
相比于其他分子诊断检测技术，qPCR 具有2项优势，即核酸扩增和检测在同一个封闭体系中通过荧光信号进行，杜绝了PCR 后开盖处理所带来扩增产物的污染; 同时通过动态监测荧光信号，可对低拷贝模板进行定量。正是由于上述技术优势，qPCR 已经成为目前临床基因扩增实验室接受程度最高的技术，在各类病毒、细菌等病原微生物的鉴定和基因定量检测、基因多态性分型、基因突变筛查、基因表达水平监控等多种临床实践中得到大量应用。但伴随着qPCR 技术的迅猛发展，有关这项技术的质量管理问题也日益突出，如何消除各类生物学变量所引起的检测变异，减少或抑制实验操作与方法学中的各种干扰因素是qPCR 技术面临的难题。
( 一 ) 实时荧光定量PCR(real-time PCR)
1.双链掺入法
1992 年Higuchi 等通过在PCR 反应液中掺入溴乙锭对每个核酸扩增热循环后的荧光强度进行测定，提出了使用荧光强度与热循环数所绘制的核酸扩增曲线，定量反应体系中初始模板的反应动力学( real-time PCR)模型，开创了通过实时闭管检测荧光信号进行核酸定量的方法。核酸染料可以嵌入DNA 双链，且只有嵌入双链时才释放荧光，在每1 次的扩增循环后检测反应管的荧光强度，绘制荧光强度-热循环数的S 形核酸扩增曲线，以荧光阈值与扩增曲线的交点在扩增循环数轴上的投影作为循环阈值( Cycle threshold，Ct) ，则Ct 与反应体系中所含初始模板数量呈负指数关系，推断初始模板量。随后Morrison提出了使用高灵敏度的双链染料SYBR Green I 进行反应体系中低拷贝模板定量的方法。这一方法操作简便，但由于仅使用扩增引物的序列启动核酸扩增，其产物特异性无法得到充分保证。虽然在实时荧光定量PCR 反应后可通过熔解曲线对产物特异性进行检验，但其特异性明显逊于使用荧光探针进行检测，因此双链掺入法并未在临床实践中得到认可。
2. Taqman 探针
由于双链掺入法存在特异性较低的问题，1996 年Heid综合之前发现的Taq 酶的5'核酸酶活性与荧光共振能量转移( fluorescence resonance energytransfer，FRET) 探针的概念提出了使用Taqman 探针进行qPCR 的方法。TaqMan 探针的本质是FRET 寡核苷酸探针，在探针的5'端标记荧光报告基团，3'端标记荧光淬灭基团，利用Taq 酶具有5' ～ 3'外切酶活性，在PCR过程中水解与靶序列结合的寡核苷酸探针，使荧光基团得以游离，释放荧光信号。从而使能够与靶序列杂交的探针在扩增过程中释放荧光，通过real-time PCR 的原理对其进行定量。由于其超高的特异性与成功的商品化推广，Taqman 探针已经成为目前临床使用最为广泛的qPCR 方法，其在各种病毒基因定量检测、基因分型、肿瘤相关基因表达检测等方面具有着不可替代的地位。
3.分子信标
同样在1996 年，Tyagi 等提出了使用分子信标( moleuclar beacons) 进行qPCR的方法，分子信标是5'与3'端分别标记有荧光报告基团与淬灭基团的寡核苷酸探针，其两端具有互补的高GC 序列，在qPCR 反应液中呈发夹结构，荧光基团与淬灭基团发生荧光共振能量转移( FRET) 而保持静息状态。当PCR 反应开始后，茎环结构在变性高温条件下打开，释放荧光;在退火过程中，靶序列特异性探针则与模板杂交保持线性，不能与模板杂交的探针则复性为茎环结构而荧光淬灭，通过检测qPCR 体系中退火时的荧光信号强度，便可以real-time PCR原理特异性检测体系中的初始模板浓度。相比于Taqman 探针，分子信标使用发卡结构使荧光基团与淬灭基团在空间上紧密结合，大大降低了检测的荧光背景，其检测特异性较Taqman 探针更高，更适合等位基因的分型检测。
4.双杂交探针
1997 年，Wittwer 等发表了使用分别标记荧光供体基团与荧光受体基团的2 条相邻寡核苷酸探针进行qPCR 的方法。双杂交探针所标记的供体基团和受体基团的激发光谱间具有一定重叠，且2 条探针与靶核酸的杂交位置应相互邻近。仅当2 条探针与靶基因同时杂交时，供体与受体基因得以接近，从而通过FRET 发生能量传递，激发荧光信号，荧光信号强度与反应体系中靶序列DNA 含量呈正比。由于使用了2条探针进行靶序列杂交，该方法的特异性比传统单探针检测体系得到了极大地提升。
( 二 ) 数字PCR
早在上世纪90 年代就出现了使用微流控阵列对单次qPCR 反应进行分散检测的概念。基于这一理念，Vgelstein 与Kinzter于1999 年发表了数字PCR( digital PCR) 的方法，对结肠癌患者粪便中的微量K-RAS 基因突变进行了定量。相比于传统的qPCR 方法，数字PCR 的核心是将qPCR 反应进行微球乳糜液化，再将乳糜液分散至芯片的微反应孔中，保证每个反应孔中仅存在≤1 个核酸模板。经过PCR 后，对每个微反应孔的荧光信号进行检测，存在靶核酸模板的反应孔会释放荧光信号，没有靶模板的反应孔就没有荧光信号，以此推算出原始溶液中待测核酸的浓度。因此，数字PCR 是1 种检测反应终点荧光信号进行绝对定量的qPCR反应，而非以模板Ct 值进行核酸定量的real-time PCR。
经由Quantalife 公司开发( 已于2011 年被BIO-RAD 收购) 的微滴式数字PCR 是首款商品化的数字PCR 检测系统，目前已被广泛运用于微量病原微生物基因检测、低负荷遗传序列鉴定、基因拷贝数变异与单细胞基因表达检测等多个临床前沿领域。与传统qPCR 相比较，该技术具有超高的灵敏度与精密度，使其成为目前qPCR 领域的新星。
半个世纪以来分子诊断的高速发展离不开分子生物学技术日新月异的进步。概而言之，在过去的50 年中分子诊断技术取得了三大转化与3项提升: 即报告信号检测从放射核素标记向荧光标记转化，操作方法由手工操作向全自动化转化，检测分析通量从单一标志物向高通量多组学联合判断转化; 检测灵敏度、精密度、特异性的快速提升。
在未来5年中，我国分子诊断事业将迎来两方面的进步。随着卫生监管部门对分子诊断重要性的认识不断深入与越来越多高学历、高素质人才的进入，分子诊断将会出现理念的革命性进步，高通量技术将更多的进入临床的实际应用中。随着技术的进一步发展，传统针对特定基因异常、病原微生物感染鉴定的方法学，也将在检测的各项分析性能与操作便捷程度上取得长足的进步。对于传统人力与时间成本较高的检测方法学，将出现两极分化的态势，即Southern 等经典的检测金标准将得到保留; 而ASO-RDB 等灵敏度、特异性均不能满足实际临床需求的方法将快速被新型技术所取代。最终，分子诊断也必将一改目前仅仅用于病原微生物基因检测与部分遗传性疾病诊断的局面，形成由肿瘤学、遗传学、微生物学、药物基因组学四足鼎立，快速发展的景象。
