融合蛋白的免疫筛选实验
基本方案
IPTG法
实验材料 | 大肠杆菌 |
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试剂、试剂盒 | LB 顶层琼脂糖 叠氮钠 第一抗体 |
仪器、耗材 | 硝酸纤维素滤膜 |
实验步骤 |
1. 在150 ml LB 平板上滴定λgt11 cDNA文库的滴度,宿主菌为大肠杆菌LE392菌株,每个平板使用7 ml 1%LB顶层琼脂。
3. 将直径132 mm 硝酸纤维素滤膜分别编号,放入上述已培养8 h的平板中,于37℃温育过夜。
4. 用针头刺孔并用印度墨汁在每张滤膜上作一标记,然后取出滤膜。
6. 将第一抗体(稀释于免疫筛选缓冲液中,终浓度为0.5~10 μg/ml)加到装有滤膜的塑料袋中,热封口后置40℃水平摇床上反应2~24 h。
7. 于4℃用免疫筛选缓冲液洗膜4~5次,毎次5~10 min。
11. 通过反复稀释,纯化λ噬菌体cDNA融合蛋白克隆,最终获得单一的阳性克隆。
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