自动酶联荧光免疫检测系统（VIDAS）筛选法介绍
自动酶联荧光免疫检测系统（VIDAS）筛选法
VIDAS 和 mini-VIDAS 是一种全自动免疫分析仪，如下图所示，它集合计算机、键盘、打印机于一身，应用酶联免疫分析原理，应用夹心技术，最终检测蓝色荧光（4-甲基伞形基磷酸盐，ELFA），所测的荧光与抗原成正比。此方法已通过 AOAC 认可，AOAC996.08方法《食品中的沙门氏菌酶联荧光免疫分析初筛方法（VIDAS®Salmonella［SLM］分析）》介绍如下。
image.png
1、原理
此沙门氏菌的抗原鉴别是基于在 VIDAS 仪器内进行的酶联荧光免疫分析。像吸液管的装置是固相容器（SPR），在分析中既作为固相也作为吸液器。SPR 包被有高特异的单克隆抗体混合物。分析的每一步都是自动进行的。在前增菌、选择性增菌和部分试验的后增菌后，煮沸一定量的增菌肉汤加入试剂条，肉汤中的混合物在特定时间内循环于 SPR 内外。如果有沙门氏菌抗原存在则与包被在 SPR 内的单克隆抗体结合，其他没有结合上的化合物被冲洗掉。接合有碱性磷酸酶的抗体在 SPR 内外循环与结合在 SPR 内壁上的沙门氏菌抗原结合，最后的冲洗步骤将没有结合的接合剂冲洗掉。底物——4-甲基伞形磷酸酮被SPR壁上的酶转换成荧光产物—4-甲基伞形酮。荧光强度由光学扫描器测定。实验结果由计算机自动分析，产生基于荧光测试的试验值与标准相比较后打印出每一个受试样品的阳性或阴性结果报告。
2、试剂
①试剂条 六十条十个孔的聚丙烯条，每一条都由锡箔密封并都有固定的标签。
②SPR 六十条，包被有抗沙门氏菌抗体。
③抗原标准液 一瓶（3mL），含有纯净的无活性的沙门氏菌抗原及0.1％的叠氮化钠和蛋白质稳定剂。
④阳性对照 一瓶（6mL），含有纯净的无活性的沙门氏菌抗原及0.1％的叠氮化钠和蛋白质稳定剂。
⑤阴性对照 一瓶（6mL），含有 TBS（Tris-缓冲生理盐水）-吐温及0.1％的叠氮化钠。
⑥M肉汤 酵母提取物5.0g，胰胨12.5g，D-甘露糖2.0g，柠檬酸钠5.0g，NaCl 5.0g，k2HPO4 5.0g，MnCl2 0.14g，MgSO4 0.8g，FeSO4 0.04g和0.75g的吐温-80。加入1L的水加热煮沸1～2min，分装到16mm×125mm带螺旋盖的试管内每管10mL，拧松盖子121℃高压15min，旋紧盖子保存。最终pH值应为7.0±0.2。
⑦诊断试剂 为可疑阳性结果的培养物鉴定分析所必须。见常规培养方法。
①～⑥可用生物梅里埃公司的 VIDAS Salmonella（SLM）分析试剂盒（BioMerieux Vitek，Inc.，595 Anglum Rd，Hazelwood，MO 63042-2320，USA）所有试剂贮存在2～8℃。可供60次测试。
3、设备
①VIDAS 或 mini-VIDAS 全自动免疫分析系统。
②培养箱 35℃±1℃和42℃±1℃。
③水浴箱 100℃。
4、通则
试剂盒内的全部试剂是作为一个整体使用的，不要将不同标号的试剂混合或任用。
试剂盒储存于2～8℃使用前放置至室温。在使用前将抗原标准液、质控标准液和煮沸过的测试肉汤各混合均匀。使用后将未用试剂立即放置2～8℃内。
每一组测试都包括一个阴性质控和阳性质控。
所有与细菌培养有关的材料或有生物危害的材料需处理和高压后使用。
5、测试液准备
①前增菌 测试样品在非选择性的培基中进行沙门氏菌增殖。前增菌依产品类型变化，但必须按照 AOAC967.26或是最新细菌分析手册，AOAC INTERNATIONAL，Gaitherburg MD20877-2417，USA，提供的方法进行。
②选择性增菌 各转接1mL前增菌培养物至装有10mL SC 肉汤和10mL TTB 肉汤试管中。除未加工食品和有大量杂菌的食品外，SC 肉汤于35℃，TTB 肉汤于42℃分别培养6h，未加工食品和有大量杂菌的食品需培养18h±2h。
③加速增菌 培养后，转接1mL TTB 培养物至10mL M 肉汤中，转接1mL SC 培养物至另10mL M 肉汤中。除未加工食品和有大量杂菌的食品外，42℃培养18h。未加工食品和有大量杂菌的食品42℃培养6h SC 肉汤于35℃，TTB肉汤于42℃继续培养24h±2h。
④加速增菌后 每一个 M 肉汤各转接1mL 于不同试管并在沸水中加热15min。剩余的 M 肉汤于4℃保存，在结果阳性时作确认用。
6、酶免疫测定
①试剂条上标注有所需编码（1是食品测试样品）。试剂盒提供每一系列测试所需的阳性对照（C1），阴性对照（C2）和抗原标准液（S1）。试剂条需恢复至室温。
②混合均匀每一阳性对照、阴性对照和抗原标准液。
③各吸取0.5mL 阳性对照、阴性对照、抗原标准液和按（5）④步骤煮沸的M肉汤加入到试剂条的测试孔中。
④输入适当分析资料建立测试数据。输入“SLM”分析编码，输入测试号码后运行。键入“S”是标准，“Pos”和“Neg”是阳性和阴性。
⑤把试剂条和固相容器（SPR）放入 VIDAS 中，按测试说明对 VIDAS 作相应选择。
⑥按 VIDAS 操作手册启动分析程序，分析将在45min内完成。
7、结果显示
计算机自动分析测试结果打印报告包括完成测试的项目，受试样品的鉴定、日期和时间，试剂盒的编码和失效日期，每一受试样品的相对荧光值（RFV），测试值和结果说明。
RFV 值是最后读数减去背景读数；测试值是 RFV 与标准的比值。结果是在测试值和控制值与储存在计算机中的极限值（0.23）比较后所得。如果测试值＜0.23则判为阴性；≥0.23则判为阳性。阳性结果需按常规方法所述的标准程序，用（5）④冷藏的 M 肉汤进一步证实。
当背景读数在预先设置值（说明培养基有轻微污染）之上时，测试结果无效。这样，需从（6）①开始重新分析。
VIDAS SLM 检测的阳性结果可以用 VIDAS ICS/SLM [免疫浓缩沙门氏菌用 SLM 检测（AOAC 2001.09）］试剂条浓缩样液中的沙门氏菌。将增菌液（不要灭活）直接加入试剂备的样品孔内上机，样液上机后甚中的沙门氏菌与固相中的抗体结合，经清洗，将杂菌等清洗掉，再将结合的沙门氏菌洗脱至取样孔中，使沙门氏菌浓缩、纯化更易于检出。45min检测结束后取出，用棉棒从取样孔内沾取样液直接划选择性平板分离沙门氏菌。
