基因插入位点和模式实验（二）
3. 跨世代 Southern 分析
Southern 分析一般用于鉴定各个转基因插入位点的排列形式（见 3 .2 节中“ Southern分析” ）。当然，通过对不同世代转基因植株杂交检测结果的比较，它也可以用于转基因插入位点数的测定。例如，根 据 T。代和自交所得到凡代植株的 Southern 分析结果就可以判定外源基因的插入位点数。以事例 2 为例，下面具体介绍这种方法。
( 1 ) 样品的 DNA 可以按照 DNA 提取试剂盒推荐的方法从植株叶片中抽提（见注3 ) ，DNA 的浓度根据所提样品在波长为 260 nm 的吸光值推算。样品提好后可以放在 4℃ 短时保存，也可以长期存储在 -20℃ 中（见注4 ) 。
( 2 ) 用于 Southern 分析的 DNA 量主要根据每个作物基因组的大小而定，一般水稻为 5 μg，大麦和小麦则需要 20 μg。DNA 样品消化时，反应体积为 50~80 μl，限制性内切核酸酶的用量为 10~15 U/μg DNA ( 见注5 ) 。另外，进行样品 DNA 消化时应同时消化阴性对照（即野生型）和阳性对照（如已经过 Southern 分析鉴定为阳性的单株）的 DNA。
( 3 ) 酶切消化后的反应液先用真空离心机浓缩到约 30 μl 的体积，然后加入到浓度为 0.8% 的琼脂糖凝胶中（用 1x 的 TBE 熔化），在 40 V 的电压下电泳过夜。同时凝胶中还应该加入1 或 2 种标记 （如 600 ng 的用 Pst I 或者 HindⅢ 酶切后的 λ 噬菌体 DNA 产物）。另外，在空白点样孔上还应加入限制酶的反应缓冲液以避免电泳时有可能发生的带偏差。
( 4 ) 电泳完毕后，用溴化乙锭染好的凝胶在紫外灯下拍下照片，以便于确定 DNA 的酶切消化程度和各个样品点样时的均一度，同时记录标记的各个条带在凝胶中的位置。
( 5 ) 凝胶先用 0.25 mol/L HCl 溶液（缓慢摇动）洗 15 min 后再用水冲洗，然后在 0.4 mol/L NaOH 溶液中变性 15 min 后，将 DNA 样品过夜印迹到尼龙膜上。转印完成后 ，将尼龙膜放入 2X SSC 溶液中洗 2 min，再用薄膜包好放在 5℃ 下短期保存或者 -20℃ 下长期保存。
( 6 ) 尼龙膜在 65°C 下先放入杂交液中预杂交 2~5 h , 杂交时要保持缓慢的摇动。50 ml 杂交液中含有 2 ml 5x HSB、1 ml Denhardt 反应液 II 和 1 ml 载体 DNA ( 在沸水中变性 7 min)。
( 7 ) 杂交使用的探针（长度大约为 500 bp) 可以通过对转化用质粒进行酶切凝胶回收（用 QIAquick Gel Extraction kit 试剂盒）后获得，也可以通过 PCR 扩增后再用 PCR 回收试剂盒（ 即 QIAquickPCR Purification kit) 回收后获得，具体操作根据产品的使用说明。25 ng ( 体积 15 μl) 的探针沸水浴 7 min 后在冰上放置 5 min，然后加入 5 μl OLB、2 μl BSA、2 μl DNA Polymerase I Klenow 片段（5 U/μl) 和 2 μl 32P dCTP 在 37℃ 下反应 2 h 以完成探针的标记。标记好的探针用 2.6 μl 3 mol/L NaOH 变性 5 min，然后加入到预杂交液中。杂交膜在预杂交液中 65℃ 缓慢振荡过夜。
( 8 ) 尼龙膜先用 500 ml 2x SSC 和 1% SDS 溶液洗两次，每次 15 min，然后再用 500 ml 0.2 X SSC 和 1% SDS 溶液洗两次，每次也是 15 min。洗好后，尼龙膜用薄膜包好。
( 9 ) 估测转基因插入的位点数：处理好的尼龙膜可以用胶片放射自显影分析或者磷屏分析。例如，在事例 2 中通过比较 T0和 T1 代植株的 Southern 分析结果可以得出转基因插入位点为两个（图 13.3 ) 。 尽管 Southern 分析方法可以精确地鉴定出转基因插入位点的数目，但是也有其局限性，具体请见注6 。此外，这种分析方法也可以用来检测后代中转基因位点结构的稳定性。当多个 DNA 片段或者载体一起转化时，Southern 分析也应该用可以公用的单个探针或者多个特异性的探针混合在一起进行杂交（即每个片段或载体一个探针）。
二、每个转基因插入位点的构型
当只有一个外源基因插入位点时，通过对 T。代植株的分子鉴定即可以了解插入位点外源基因的拷贝数和排列方式。当发现转基因植株中有多个插入位点时（ 根据 3.1节中的方法鉴定），则要对每个插入位点逐个进行分析，其主要是采用分析分离群体的单株，或者分析各个位点的纯合系的方法。
1. Southern 分析
在鉴定转基因插入位点的构型时，Southern 分析是最常用的方法。通过酶切和能覆盖用于转化的全长 DNA 序列 （包括载体的骨架序列）的探针的联合分析，可以重构出每个插入位点的全部结构。首先要做的是估测每个插入位点的外源基因拷贝数（保持原样或者重排）。根据插入位点的复杂性采用不同的方法进行分析。下面分别介绍含有一个或少数几个的拷贝数的简单转基因插入位点，以及含有大量拷贝数的复杂转基因插入位点的具体分析方法。
( 1 ) DNA 的提取、膜的制备和杂交具体可以参考 3.1 节步骤 1~ 8。植物基因组 DNA —般采用单酶切，本例中用的是质粒中的 Xbal 酶切位点。使用的探针必须可以与酶切位点 5 ' ( 以潮霉素基因为例）或者 3 ' ( 以 β-葡萄糖醛酸酶基因为例）端的外源基因序列特异性杂交（见注 8) 。
( 2 ) 用放射自显影仪或者感光成像仪对膜进行初步分析，根据所得的结果一般就可以对每个插入位点的复杂性进行初步的评估。
① 简单插入位点的分析
经过酶切和探针杂交后，Southern 分析所得结果产生最多 4 条亮度相近的杂交条带 ( 如事例 2 位点 1 和位点2) 。
a. 用于 Southern 分析（3.1 节步骤 1~8 ) 的限制性内切核酸酶（ 见注 9 ) 和探针可以参照表13. 4 的常用方法。通过 Southern 分析不仅可以对转基因位点区域内的序列进行研究，也可以对两边近邻序列进行分析。如果需要更为精确的结果，推荐最好还是用多种不同的酶和探针进行多次分析。例如，在事例 2 的位点1 中 （ 图 13.4)，应该再用 Hind Ⅲ 作为限制性内切核酸酶酶切，该酶切位点位于 β- 葡萄糖醛酸酶基因表达区的侧边，用 β- 葡萄糖醛酸酶基因启动子或终止子的序列作为探针进行杂交分析，因为在该插入位点上可能存在多拷贝和重排的外源基因。另外，利用与载体抗性基因序列特异性结合的探针还可以检测转基因个体中是否含有载体序列。
b. 事例 2 位点 1 的结构鉴定：经过 Xba I 和 HindⅢ 酶切及 β-葡萄糖醛酸酶基因探针杂交后，膜上出现的多个条带说明该插入位点可能含有多拷贝的 β-葡萄糖醛酸酶基因，一个完整和一个可能缺失的。但是，潮霉素基因和 NPTI 基因探针的杂交条带却只有一条，这个结果表明载体序列已经转染和整合到了植物基因组上。这主要是因为 T-DNA 的左边界的无效识别/剪切，导致对 T-DNA 序列的 “通读”引起的（见注 10)。根据杂交条带的大小，则可以推测出插入位点序列形成的结构（图 13.4)。
c. 事例 2 位点 2 的结构鉴定：用 β- 葡萄糖醛酸酶基因和潮霉素基因的探针进行杂交时只有一条带。用的探针杂交时没有信号，表明载体主骨架没有整合到植物基因组上。根据杂交条带的大小可以推测出该位点序列所形成的结构（图 13.5)。
② 复杂插入位点的分析
通过多种不同的限制性内切核酸酶和探针对事例 1 进行 Southern 分析，发现杂交结果中有 4 条或以上信号强度不同的杂交带（图 13. 6) 。对于这种情况，杂交结果一般不太可靠 [ 17 ] , 单独的结果也不能用来精确地推测插入位点的构型和外源基因的拷贝数 ( 见注 11)。但是通过对杂交信号的光密度分析，还是可以估测转基因以及外源基因完整的表达单位（即启动子+基因+终止子）的拷贝数。用转基因载体上所没有的酶切位点进行 Southern 分析时，通过所得的结果也可以帮助了解插入位点处植物基因组序列的存在情况。
( a ) DNA 的提取可以参考3. 1 节步骤 1。必须先精确测定野生型植物基因组 DNA 浓度和作为标样的质粒 DNA 浓度，以便于后续的光密度分析（见注 12)。
( b ) DNA 的消化可以参考3.1 步骤 2 。与 1 、 2 、5 、10、 20 、40 和 80 拷贝外源基因相当的标样分别加入 5 μg 野生型 DNA 中 （ 见注 13 ) , 另外推荐在每张膜上加入阳性对照 （ 见注 14)。
( c ) Southern 分析主要参考3. 1 节步骤 3~8，利用 β- 葡萄糖醛酸酶基因表达区相邻的 Hind Ⅲ 酶切位点，或者是 Pac I 、Nhe I 、Bst X I 、Apa I 和 Kpn I 等转化载体上无酶切位点的酶，降解植物基因组 DNA。分析时需要4 种不同的探针：1 个单拷贝的 RFLP 探针；3 个分别可以与 β- 葡萄糖醛酸酶基因、潮霉素基因和 NPTI 基因特异性结合的探针。RFLP 探针是为了保证各个样品所加样量的均一性（见注 14)。经过 Hind Ⅲ 酶切后的杂交，一 些条带的大小和质粒 DNA 酶切产生的（CfAS) 的表达区（2.9 kb) 相似，而其他的更大或小一些的条带可能是由 DNA 重排所致。利用 Spe I 和 HPT 基因探针的 Southern 分析的结果与上面类似（ 图 13.6) 。而利用载体无酶切位点的 Apa l 进行酶切时，β- 葡萄糖醛酸酶基因探针杂交出了两条带，由此表明该插入位点内可能还含有部分植物基因组序列。事例 1 中存在着大量拷贝的 NPT I 基因，也证实了载体序列的整入( 因为基因枪法使用的是完整的载体质粒）。然而根据这些信息仍然无法得出事例 1 中转基因插入位点的构型。
( d ) 事例 1 中转基因拷贝数的鉴定：杂交膜上除去背景后所有杂交信号的强度都可以用光密度计（Bio-Rad 690 ) 或感光成像仪等仪器进行定量分析。根据信号的强度和基因拷贝数的相关性，通过回归分析可以重建标准曲线。依照标准曲线和酶-探针联合分析的结果，则可以推测出每个样品外源基因的拷贝数（ 见注 15 ) 。Hind Ⅲ、Spe l 和 Xba I 酶切后杂交的信号表明转基因事例 1 中含有 36 个拷贝的 β- 葡萄糖醛酸酶基因和 14 个拷贝的潮霉素基因（图 13. 6 ) 。
2. 其他方法
通过 Southern 杂交分析，对每个转基因插入位点的总体结构有了一个大致的了解。但是要想完全掌握转基因插入位点的所有信息，则需要对插入区和近邻的基因组序列进行测序分析 [18, 19 ] ，有时对基因组 DNA 的序列分析更为重要。本章中，对此方法不做详细介绍，但是，拟南芥 [ 20 , 2 1 ] 和 水 稻 [ 22 ] 等模式植物的转基因近邻序列高通量分析方法已见诸报道。根据插入区近邻植物基因组序列的测序结果，可以设计 PCR 引物，逐步地对整个插入区进行扩增和测序。此外，依照近邻序列所设计的引物，还可以用于野生型基因组序列的扩增分析，从而可以鉴定出外源基因插入位点处是否存在基因组序列的丢失。同时，DNA 测序还能鉴定出转基因时是否发生了叶绿体 DNA 和外源基因的共整合。
