酵母细胞核制备实验——差速离心法
细胞核（nucleus）是细胞中最大、最重要的细胞器（初中老教材认为细胞核不是细胞器，大学细胞生物学则认为是细胞器，这里以大学教材为准），它是由核膜（nuclear membrane）、核骨架（nuclear scaffold）、核仁(nucleolus) 几部分组成。
| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 将酵母菌接种于YPD培养基（100 ml 到20 L），剧烈摇动或强制通气条件下培养至对数中期（OD600≈1~5）。培养物在预称重的离心瓶中于4℃， 1 500 g 离心5 min。
2. 确定酵母细胞的湿重，它与压紧的细胞体积大致相同。在所有的后续步骤中菌体的量将当作1体积来考虑。
3. 细胞用2~4体积冰水重悬，并立即于4℃，1 500 g 离心5 min，加入1体积含30 mmol/l DTT的酵母消解酶缓冲液重悬细胞、室温放置15 min。
5. 在每毫升原压紧细胞中加入2 mg（200 U）酵母消解酶-100T，于30℃水平摇床以大约50 r/min 的转速温育40 min，通过水渗破法确定菌体是否完全转变为原生质体，如果原生质体化不完全，应继续温育直到完全。
6. 1 500 g 离心原生质体5 min，小心弃上清，原生质体球沉淀块不如细胞沉淀块般紧密。
7. 用2体积冰冷的酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，原生质体1 500 g 离心5 min，重复2次。
10. 将悬浮液转移到离心管中，于4℃，3 000 g 离心5 min，如果要完全除去细胞碎片， 重复离心几次。
11. 将上清转移至一个新的离心管中，于4℃12 000 g 离心20 min，沉淀用5~10倍体积的细胞核缓冲液重悬；再于4℃，12 000 g 离心。
12. 为了获得细胞胞核裂解液，用1体积裂解缓冲液重悬细胞核沉淀。 13. 用2体枳酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，不要试图得到均一的悬液，只需将沉淀物从管壁上洗下来，悬转10~20次，于1 500 g 离心10 min 回收原生质体。
15. 在Dounce 匀浆器中用最紧密的研杵，冲击15~20次以裂解原生质体。
18. 取出几微升透析液，用水作1 ：1 000稀释，测定电导率。如果和类似稀释度的贮存缓冲液相等或低于一定值时（通常100~250 mmol/l NaCl），继续步骤19，否则继续透析。
19. 于4℃，10 000 g 离心10 min。收集透析液上清。分成小份放在液氮中冷冻，于 -80℃贮存。 展开 |
