叶盘转化法
实验概要
本实验介绍了根癌农杆菌介导的植物转化－叶盘转化法的原理及操作步骤。了解根癌农杆菌介导的植物基因转化的方法和用途，掌握叶盘转化法的基本原理和操作。
实验原理
以根癌农杆菌介导的遗传转化是目前最有效的途径之一。根癌农杆菌对植物释放的化学物质产生趋化反应，向植物受伤组织集中。经共培养后，受伤部位的化学诱导物透过农杆菌的细胞膜使Ti质粒上的Vir基因活化。Vir基因产物使Ti质粒上的T－DNA进入植物细胞，并整合到植物核基因组中。插入在T－DNA左右边界区内的目的基因也随之整合到植物染色体上，从而使目的基因在植物细胞中得到表达。
主要试剂
1. YEB液体培养基
2. 抗菌素储备液(Kan，Cif，Rif，Amp)
3. MS基本培养基
4. MS分化培养基
5. 70％乙醇
6. 0.1%升汞
主要设备
1. 超净工作台
2. 27℃恒温摇床
3. 无菌小培养皿
实验材料
1. 烟草、甘蓝无菌苗或田间生长的植株
2. 含目的基因的共整合载体或双元载体的根癌农杆菌
实验步骤
1. 取幼嫩健康的叶片，用蒸馏水冲洗一遍，70％乙醇洗45秒，0.1%升汞消毒6－8分钟，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干水分。
2. 将无菌叶片剪成份12.5px×12.5px的小块，叶片近轴面向下，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上，预培养2－3天。
3. 挑取一个单菌落根癌农杆菌，接种到20ml附加相应抗生素的YEB培养液中，在27℃恒温摇床上培养到OD值为0.6-0.8。取上述上培养物按1％－2％的比例，转入新鲜的无抗菌素的YEB培养液中，继续培养6小时，当OD值为0.2-0.5时即可用于转化。
4. 在超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿，从培养液中取出预培养的外植体，放入菌液中泡1－5分钟。取出外植体在无菌滤纸上吸去附着的菌液。然后接种在愈伤组织诱导或分化培养基（烟草的培养基为MS附加IAA0.5mg/L，BA2.0mg/L）上，28℃暗培养2－4天。
5. 将经过共培养的外植体转移到加有选择压的脱菌分化和愈伤组织诱导培养基上。在光照的条件下，25℃进行选择培养。
6. 选择培养2－3周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽，或者产生抗性愈伤组织。将这些抗性材料转移到相应继代选择培养基上，或者转入附加选择压的生长和分化培养基中，令其生长和诱导分化。
7. 待不定芽长到25px以上时，切下并插入含有选择压的生根培养基上进行根培养，两周左右长出不定根。
注意事项
1. 培养材料的选择，需要选择生长较好的材料。
2. 植物材料的灭菌，要根据不同的材料来确定，材料允许的话，可以设计实验取得最佳的灭菌处理。
3. 培养基的配置。要根据不同的材料，不同的物种，选择合适的培养基，最好有一组实验取得。做培养基的过程中注意调剂培养基的PH值，有些高温分解的激素要过滤灭菌等。
4. 培养条件的选择，包括光照、温度、湿度等。
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政策法规
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